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(1.福建中医药大学，福建 福州 350003；2.福建中医药大学附属第二人民医院 呼吸内科，福建 福州 350003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)作为呼吸系统的常见病之一，若延误治疗，将会演变为慢性肺源性心脏病。肺血管重塑是COPD病情发展中的重要病理过程[1]，且在COPD初期即有肺血管的改变形成，若不及时控制将会使病情进行性恶化。研究表明[2]，COPD组患者肺小动脉存在明显的肺血管重塑现象，在COPD大鼠实验中亦见相同结果[3]。整联蛋白αM(Integrin Alpha M，ITGAM)在COPD患者中高表达[4]，且ITGAM的减少可延缓由慢性缺氧引起的肺动脉高压的发展[5]。全真一气汤系明朝医学家冯兆张著作中的方剂[6]，临床上使用此方治肾不纳气型COPD患者，颇具疗效[7-8]。本实验在前人研究的基础上，使用全真一气汤干预COPD模型大鼠，检测大鼠右肺组织中ITGAM基因及蛋白水平，探讨全真一气汤对COPD大鼠ITGAM水平的影响，旨在为全真一气汤治疗COPD提供更多实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物

18只清洁级SD大鼠采购自广东省医学实验动物中心(合格证号：70092411)的(180～220 g)。本研究医学实验于福建中医药研究院动物实验中心鼠类实验室开展，清洁级。动物使用规范符合《福建省医学实验动物管理委员会管理条例》。

1.2 药物

采用由全真一气汤生药制成40%的中药浓缩汤剂，按0.4 mL/20 g剂量喂养，每日上午8∶00-9∶00灌胃1次。中药制法：①称取生药226 g，于水中浸泡30 min后，再由电炉加热至沸腾，沸腾后再煎30 min，取滤液；②取滤渣，注水，二次加热至沸腾后，再煎20 min，再次过滤；③2次滤液混合，加热浓缩至体积为226 mL，相当于原材料1.0 g/mL。原药材由福建省药材公司提供，中药浓缩汤剂全程由福建中医药大学附属第二人民医院制剂中心加工完成。

1.3 试剂与仪器

SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa公司, Code：DRR820A)；RNAiso Plus(TaKaRa公司，Code：D9108A)；ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒(TaKaRa公司, Code：DRR037A)；Rat_Gapdh_primer(TaKaRa公司，Code：D379212)；兔抗大鼠ITGAM抗体(美国Santa Craz公司)；戊二醛(上海化学试剂有限公司)；四氧化锇(上海化学试剂有限公司)；7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国 ABI公司)；Westen-blotting(美国 BIO-RAD)。

2 方法

2.1 动物模型建立、分组及给药方法

将18只SPF级大鼠随机分成模型组、中药组，每组各9只。模型组、中药组分别于实验第1天、第11天、第21天使用10 %水合氯醛将大鼠麻醉，手术暴露气管，经气管注入内毒素LPS 200 μL(1 mg/mL)。两组大鼠自第2天起连续烟熏造模，具体为将其放置于30 cm×40 cm×50 cm的有机玻璃熏箱中，箱中烟熏浓度维持于5%左右，烟熏30 min后移至通风处，共60 d(气管内滴注日不烟熏)。于第2天起，模型组大鼠予以生理盐水5 mL/d灌服，中药组大鼠予以全真一气汤浓缩液(生药制成40 %的浓缩汤剂，按0.4 mL/20 g/d)灌服，两组均连续灌服60 d。第60天，于每组随机取3只大鼠用于取材，取材部位为右肺组织，取材完毕后用消毒锡箔纸将肺组织标本包裹并速冻于液氮中，再转至-80 ℃冰箱保存，以便用于实时荧光定量PCR及Western Blot检测。

2.2 观察指标与测定方法

2.2.1 实时荧光定量PCR检测 取右肺组织，采用TRIzol(invitrogen)法抽提取总RNA后，用ExScriptTM RT Reagent Kit试剂盒将其逆转录为cDNA，再由SYBR Premix Ex Taq II试剂盒以7500 Software v2.0.5进行荧光扩增。使用SYBR Green I嵌合荧光法，引物设计参照 Genebank序列，该序列由自宝生物工程(大连)有限公司合成，基因的上下游引物序列检测情况见表1。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃延伸1 min，40个循环，GAPDH作为内参照。将模型组mRNA的表达量表示为“1”，再通过校正值计算出中药组mRNA的相对含量，并比较组间相对量。

2.2.2 Western blot检测ITGAM蛋白水平 称量后的组织块按比例(1∶10)加入对应的裂解液中进行匀浆，离心后取上清，BCA法测定蛋白浓度。加入buffer，100 ℃变性后，取20 μg电泳，转膜，于室温条件下将之浸入于含5 %脱脂奶粉并封闭1 h，加入一抗(ITGAM；CST公司)，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(碧云天，HRP标记)，室温孵育lh，使用TBST将其充分洗涤后，标本膜上的信号由增强的化学发光系统(ECL)检测。

表1 检测基因的引物序列和产物长度

3 结果

3.1 PCR结果

中药组大鼠ITGAM mRNA表达水平较模型组降低，其表达丰度为模型组的0.630，P值为0.0026(P<0.05)，差异具有统计学意义。见表2、图1。

表2 模型组与中药组大鼠ITGAM mRNA表达比较

图1 模型组与中药组大鼠ITGAM mRNA表达比较

注：中药组与模型组比较，P<0.05。

3.2 Western blot检测

中药组大鼠ITGAM蛋白表达水平较模型组下调。见图2。

图2 各组大鼠ITGAM蛋白表达水平

4 讨论

COPD是可预防以及治疗的疾病，其发病机制的核心是气道和肺组织(如肺血管、肺实质)长期持续的炎症病变，而肺血管存在的持续性炎症改变与肺血管重塑紧密相关[9]，且与COPD相关的慢性低氧、炎症以及吸烟会诱导肺血管重塑形成。研究表明[10]，COPD肺血管重塑的特征为血管平滑肌细胞、内皮细胞增殖以及细胞外基质成分增加等。中性粒细胞作为与COPD密切联系的炎症因子，其可分泌大量炎性蛋白，促进持续性炎症，影响内皮细胞，并导致血管壁结构改变和功能发生异常，而ITGAM的下降可显著降低中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附[11]，以延缓肺血管重塑。

ITGAM(Integrin， Alpha M)是构成整合素αMβ2 的一种蛋白质亚基，表达于骨髓细胞如中性粒细胞、单核巨噬细胞等[12]。ITGAM基因位于第16号染色体短臂11 区2带，约79.08 kb，由30个外显子、36个内含子构成，其mRNA有12个剪切体[13]，具有调节白细胞活化、黏附和迁移的功能[14]。ITGAM可编码整合素的α链产生CD11b，高水平的CD11b可使中性粒细胞同参与肺血管重塑相关的细胞和细胞外基质的黏附增加[15]，影响血管壁结构和功能异常。CD11b可与结缔组织生长因子CTGF结合，参与肺血管重塑[16]。有研究[17]显示，CD11b参与缺氧所致的肺血管重塑，CD11b在肺动脉高压组中高表达[18-19]。ITGAM可编码整合素的β链产生CD18，CD18再与CD11b以非共价键结合的方式形成结合物CD11b/CD18[20]，CD11b/CDl8参与肺血管重塑[21]。CD11b/CDl8分布于CD8+T细胞[20]，而COPD者的肺血管可见大量CD8+T淋巴细胞浸润[10]。此外，由ITGAM编码产生的CD11b/CD18为中性粒细胞上的重要β2整合素受体，同时乃炎症反应、介导组织损伤的主要受体[20]，且慢性低氧可促进血小板活化因子PAF增加，从而使CD11b/CD18水平上调，使内皮细胞和中性粒细胞的黏附增加[22]，加剧肺血管重塑。

中医对于COPD常以肺胀等疾病辨证施治，病因有内、外之别，内因主要与肺脾肾三脏功能失调密切相关。COPD属于慢性疾病，病程长，病性多属虚，大部分患者有呼多吸少、气短等肾不纳气症状，与中医久病易致体虚、久病伤肾的特点相符合。全真一气汤主治肾不纳气型疾病，由熟地黄、人参、白术、五味子、麦冬、牛膝、附子组成[6]，具有同补肺脾肾三脏之功效。现代药理学研究表明，人参皂苷Rb1可舒张肺动脉，抑制由慢性低氧导致的肺动脉高压大鼠的肺血管环的收缩效应[23]；怀牛膝具有直接舒张血管内皮细胞的作用[24]，而附子亦可舒张肺动脉[25]，故笔者推测全真一气汤可能具有延缓肺血管重塑的功效。

本实验研究结果表明，给予全真一气汤的COPD大鼠肺组织ITGAM水平较模型组明显下调，推测全真一气汤可能通过下调ITGAM水平影响肺血管炎症病变，从而延缓肺血管重塑过程。