杨传来,李巧巧,夏任兰,孙兴伟

(苏州大学附属第二医院,江苏苏州 215004)

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率居我国泌尿系统恶性肿瘤第一位[1]。膀胱癌的病因较复杂，既有遗传因素，又有外界环境的影响，其中吸烟[2]和芳香胺类化学物质[3]是膀胱癌的诱因。临床治疗膀胱癌的标准是膀胱切除术配合化疗与放疗，但术后复发和转移率仍较高[4]。一旦膀胱癌出现复发和转移，其2年病死率极高。神经前体细胞表达下调因子4(NEDD4)是一种E3泛素连接酶，其主要下游靶蛋白包括PTEN[5]、p53[6]、p73[6]、LATS1[7]、VEGFR2[8]等。研究[9]表明，NEDD4在人类癌症发生和恶性进展中发挥关键作用。研究发现，NEDD4在胰腺癌[10]、乳腺癌[11]、结直肠癌[12]和膀胱癌[13]中均呈高表达。尽管NEDD4在多数肿瘤中呈高表达并能促进肿瘤的发生，然而其在膀胱癌中的研究较少。2019年1月，我们探讨了NEDD4基因沉默对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌细胞T24和RT4购自American Type CultureCollection(ATCC)。MTT购自Sigma公司(USA)。Lipofectamine 2000、TRIzol购自Invitrogen公司(USA)。逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司(USA)。SYBR green PCR master mix购自Applied Biosystems公司(USA)。抗Tubulin单克隆抗体购自Sigma公司。抗NEDD4抗体购自Cell Signaling Technology公司(USA)。靶向NEDD4的siRNA(NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3)由苏州吉玛基因公司合成。实时RT-PCR引物由苏州金唯智生物有限公司合成；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 靶向NEDD4的siRNA合成 NEDD4siRNA-1正向引物：5′-CCUAACAGAUGCUGAGAAUTT-3′，反向引物：5′-AUUCUCAGCAUCUGUUAGGTT-3′；NEDD4siRNA-2正向引物：5′-GCAAGGAUUCCUUCCUAAATT-3′，反向引物：5′-UUUAGGAAGGAAUCCUUGCTT-3′；NEDD4siR-NA-3正向引物：5′-GGAGAAUUAUGGGUGUCAATT-3′，反向引物：5′-UUGACACCCAUAAUUCUCCTT-3′。同时合成Negitive Control siRNA作为阴性对照，正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。每组siRNA用DEPC水溶解，并稀释成浓度为20 μmol/L的溶液，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.3 细胞培养、分组及siRNA转染 人膀胱癌细胞T24和RT4常规培养于含10%FBS、100 U/mL双抗的DMEM培养基中并置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。每2～3 d用0.25%胰酶消化、传代。转染前24 h将细胞接种于6孔板中，当细胞融合度约70%时换无双抗、无血清的DMEM培养基。设立空白对照组、阴性对照组和实验组，参照Lipofectamine 2000说明书的操作步骤和量将NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3、Negitive Control siRNA转入细胞中，空白对照组为野生型T24和RT4细胞，不予转染；阴性对照组细胞转染Negative Control siRNA，实验组细胞转染NEDD4siRNA-2。转染4 h后更换为含有10%FBS的培养基继续培养，48 h后提取细胞RNA和蛋白质。

1.4 NEDD4的mRNA和蛋白表达检测 采用RT-PCR法和Western blotting法。收集转染后的T24和RT4细胞，用TRIzol试剂法提取各组细胞的总RNA，并利用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA。随后以此cDNA为模板，进行RT-PCR，根据人NEDD4基因和内参GAPDH基因设计引物为NEDD4：正向引物5′-GAAGATCTACCATGGCAGCCGACGACACTGAG-3′,反向引物：5′-CGGAATTCT CAATCAACCCCATCAAAGCCCTG-3′；GAPDH：正向引物5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物：5′-CAGTGAGCT TCCCGTTCAG- 3′。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s；58 ℃ 20 s；70 ℃ 10 s，40个循环。各组重复检测3次，以2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。消化收集转染后的T24和RT4细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，用10%的SDS-PAGE胶将提取的40 μg总蛋白进行电泳分离，然后半干法转PVDF膜，封闭1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin和NEDD4的一抗稀释液4 ℃孵育过夜，第2天将膜取出用TBST液洗涤3次后孵育羊抗兔HRP标记二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h后用TBST液洗涤3次。将ECL显影液的A液与B液按照1∶1混合。并反复滴加到NC膜上，将胶片放在NC膜上，紧扣暗匣子，用洗片机对其显影。用Image J软件分析蛋白电泳条带灰度值，并计算NEDD4蛋白的相对表达量。

1.5 细胞增殖率测算 采用MTT法。收集对数生长期的T24和RT4细胞，稀释成密度为6×104/mL的细胞悬液，各取100 μL接种于96孔板中。24 h后当细胞融合度约70%时换无双抗、无血清的DMEM培养基。设立空白对照组、阴性对照组和实验组，参照Lipofectamine 2000说明书的操作步骤和量将siRNA转入细胞中，空白对照组为野生型T24和RT4细胞，不予转染；阴性对照组细胞转染Negative Control siRNA，实验组细胞转染NEDD4siRNA-2。转染4 h后更换为含有10%FBS的培养基继续培养48 h或72 h。每孔加入MTT 20 μL，混匀，再继续孵育4 h，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，充分混匀后用酶标仪检测490 nm 波长处吸光度值。每组设置3个平行孔，实验重复3次。

1.6 细胞迁移率测算 采用细胞划痕实验。设立空白对照组、阴性对照组和实验组，空白对照组为野生型T24和RT4细胞，不予转染；阴性对照组细胞转染Negative Control siRNA，实验组细胞转染NEDD4siRNA-2。将转染后的T24和RT4细胞消化、计数并以每孔5×104个细胞接种于24孔板内，每组设置3个平行孔。划痕后0和20 h分别观察拍照，计算细胞迁移率。细胞迁移率=(1-20 h时划痕宽度/初始划痕宽度)×100%。实验重复3次。

1.7 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。设立空白对照组、阴性对照组和实验组，空白对照组为野生型T24和RT4细胞，不予转染；阴性对照组转染Negative Control siRNA，实验组转染NEDD4siRNA-2。胰酶消化转染后的T24和RT4细胞，低速离心。用无血清培养基重悬，并稀释至1×105/mL，取200 μL细胞加入到Transwell上层小室，并在下层小室内加入500 μL含有10%FBS的培养基作为趋化因子。将带有Transwell小室的24孔板置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。20 h后取出培养板，吸弃上室内培养基，用棉签小心擦去上表面未侵袭的细胞和Matrigel，用眼科剪和镊子剪取基底膜，置于新的24孔板内，用PBS小心冲洗1次，侵袭的细胞用吉姆萨染液染色并用OLYMPUS生物智能导航仪拍照，随机选取6个不同视野进行细胞数统计。实验重复3次。

1.8 NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表达检测 取T24和RT4细胞，设立空白对照组、阴性对照组和实验组，空白对照组为野生型T24和RT4细胞，不予转染；阴性对照组细胞转染Negative Control siRNA，实验组细胞转染NEDD4siRNA-2。转染48 h后提取蛋白质，消化收集转染后的T24和RT4细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，用10%的SDS-PAGE胶将提取的40 μg总蛋白进行电泳分离，然后半干法转PVDF膜，封闭1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin、NEDD4、PTEN和p73的一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，第2天将膜取出，用TBST液洗涤3次，孵育羊抗兔HRP标记二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h后用TBST液洗涤3次。将ECL显影液的A液与B液按1∶1混合。并反复滴加到NC膜上，将胶片放在NC膜上，紧扣暗匣子，用洗片机对其显影。用Image J软件分析蛋白条带灰度值，并计算NEDD4、PTEN和p73蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组NEDD4的mRNA和蛋白表达比较 三条靶向NEDD4的siRNA均能下调细胞内NEDD4 mRNA和蛋白表达，其中siRNA-2片段干扰效率最高，差异有统计学意义(P<0.001)。在T24细胞中，阴性对照组、空白对照组、NEDD4siRNA-1组、NEDD4siRNA-2组、NEDD4siRNA-3组NEDD4 mRNA的相对表达量分别为1.03±0.11、1.00±0.13、0.33±0.06、0.20±0.06、0.52±0.05，蛋白相对表达量分别为1.08±0.04、1.00±0.05、0.51±0.07、0.15±0.02、0.33±0.03。在RT4细胞中，阴性对照组、空白对照组、NEDD4siRNA-1组、NEDD4siRNA-2组、NEDD4siRNA-3组NEDD4 mRNA的相对表达量分别为0.97±0.07、1.00±0.11、0.39±0.03、0.30±0.07、0.65±0.08，蛋白相对表达量分别为0.87±0.02、1.00±0.07、0.41±0.04、0.34±0.03、0.46±0.03。

2.2 各组细胞增殖率比较 T24细胞转染48 h时空白对照组、阴性对照组、实验组细胞增殖率分别为100.00%± 8.00%、96.67%± 3.22%、65.02%±5.03%，72 h时分别为100.00%±12.00%、92.12%±5.30%、41.33%±6.35%，与阴性对照组相比，实验组细胞增殖率降低(P均<0.01)。RT4细胞转染48 h时空白对照组、阴性对照组、实验组细胞增殖率分别为100.00%±10.40%、91.04%± 6.25%、 64.98%±9.54%，72 h时分别为100.00%±15.12%、92.67%±5.51%、41.33%±10.02%，与阴性对照组相比，实验组细胞增殖率降低(P均<0.01)。

2.3 各组细胞迁移率比较 转染后20 h空白对照组、阴性对照组、实验组T24细胞迁移率分别为76%±9%、71%±10%、31%±4%，RT4细胞迁移率分别为70%±4%、66%±4%、35%±2%，与阴性对照组相比，实验组细胞迁移率降低(P均<0.01)。

2.4 各组细胞侵袭能力比较 空白对照组、阴性对照组、实验组T24侵袭细胞数分别为(48.67±3.06)、( 45.67±1.53)、(26.67±1.16)个/视野，RT4侵袭细胞数分别为(60.33±3.06)、(56.33±2.86 )、(28.00±4.00)个/视野，与阴性对照组相比，实验组侵袭细胞数降低(P均<0.01)。

2.5 各组NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表达比较 空白对照组、阴性对照组、实验组T24细胞中NEDD4蛋白相对表达量分别为0.99±0.04、0.96±0.02、0.44 ±0.01，PTEN蛋白相对表达量分别为 1.01±0.08、1.29±0.06、4.15±0.10，p73蛋白相对表达量分别为0.99±0.04、1.08±0.05、3.97±0.06，与阴性对照组相比，实验组NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表达均增加(P均<0.001)。空白对照组、阴性对照组、实验组RT4细胞中NEDD4蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、1.06±0.02、0.40 ±0.01，PTEN蛋白相对表达量分别为 1.01±0.06、1.49±0.10、3.10±0.16，p73蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、1.20±0.03、1.86±0.04，与阴性对照组相比，实验组NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表达均增加(P均<0.001)。

3 讨论

膀胱癌是我国高发的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率占泌尿系统恶性肿瘤之首。病理上膀胱癌分为肌层浸润性和非肌层浸润性两种，前者常采用的治疗方案为膀胱切除术，后者多采用经尿道膀胱肿瘤电切术，但膀胱癌术后的转移和复发率仍较高。因此，有必要深入了解膀胱癌发生转移、侵袭的分子机制。肿瘤的发生是一种多基因、多步骤、多因素的慢性复杂过程。研究[14]认为，肿瘤的发生是由于细胞内蛋白表达发生紊乱，促癌基因表达增加，而抑癌基因表达下调或失活。肿瘤细胞最主要的特点就是增殖不受限制，最终侵袭其他细胞或组织。

NEDD4是一种重要的E3泛素连接酶，在结构上，NEDD4由具有催化功能的C-端HECT结构域和具有底物识别功能的N-端结构域(包括一个C2结构域和一系列WW结构域)组成。近年研究发现，NEDD4在肿瘤的发生发展中发挥重要功能。NEDD4参与耐药鼻咽癌细胞的上皮-间充质转化[15]。研究表明,NEDD4在包括膀胱癌在内的多种肿瘤组织中表达上调，然而其表达与肿瘤大小、分级及分期并无关联。NEDD4主要在内质网、溶酶体和蛋白酶体中以泛素依赖性方式介导蛋白质降解，发挥生物学功能[16]。Wang等[5]研究发现，NEDD4能直接靶向泛素化降解PTEN，并以依赖沉默PTEN方式抑制异种移植瘤的生长。此外，NEDD还能通过靶向泛素化降解LATS1而抑制Hippo信号通路[7]。以上研究表明NEDD4在多数肿瘤中发挥肿瘤促进功能，因此，靶向沉默NEDD4可能是治疗人类癌症的有效策略。

基于以上研究，我们推测NEDD4通过调控PTEN和p73表达参与膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本实验结果表明，PTEN和p73蛋白表达随NEDD4的沉默而上调，且能下调膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此与我们之前的推测相符。

Ye等[9]提出，NEDD4是调控诸多肿瘤发生与恶性进展的信号通路，是一个潜在的肿瘤治疗靶点。本研究证实，沉默NEDD4通过上调其下游靶分子PTEN和p73蛋白而抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

综上所述，NEDD4基因沉默能抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。