陈绍华，徐 浩，王拥军，梁倩倩＊＊

（1. 上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2. 上海中医药大学附属龙华医院天山分院 上海 200051）

新药研发需要很长的时间周期和大量资金的投入[1]。高通量药物筛选是新药研发的重要方法，该方法缩短了新药的研发周期，降低了成本；同时药筛模型可以重复应用，节省了资源；但也存在着不足，现有大多数平台都是使用2D 培养法，主要从分子、细胞水平进行药物筛选，不能体现各细胞以及细胞和细胞外基质之间的关系，不能体现药物在体内的吸收、分布、代谢及排泄等过程。于是，3D 细胞培养系统应运而生，它能模仿体内各级组织结构的组成，相比于2D 模型更加接近体内的状态，3D体外模型正在成为传统的2D 模型和体内动物模型之间的桥梁[2]。3D 模型可以逼真的模仿天然组织，提高了药物发现过程中寻找候选药物的药效和毒副作用的能力，极大地提高了药筛的进程，加快了新药进入临床应用的速度。然而，3D模型的体外制造仍然是3D 模型建立的瓶颈，而3D 打印制造技术的出现和快速发展将有助于我们去突破这个瓶颈。

3D打印制造技术正快速地向生物医学领域渗透。从第一台3D 生物打印机问世，在过去短短8年时间里取得了快速发展。PENG W 等人就曾撰文指出3D 打印相关组织模型的可能性，认为这项新技术在建立生理病理体外模型和高通量药物筛选中具有巨大的潜力和发展前景[3]。伴随着生物打印技术的革新，以及生物打印材料的不断进步，其在组织工程学、药物研发以及再生医学领域发展迅速。3D 生物打印技术是基于全面收集的被打印组织的数据，通过计算机软件分析建立三维模型，通过3D 生物打印机装配特制的生物墨水，最终打印制造出人造组织、器官和其它生物医学产品的新科技手段[4]。它是生物材料和活细胞在指定的组织中同步定位、逐层堆叠，进行3D 结构的制造，并且在活细胞、蛋白质、DNA 及生长因子等生物活性物质的时空定位上具有很高的精度，可以诱导组织的生成和形成。细胞可以直接使用打印机流体分配装置打印，或者直接打印出生理病理的相关组织模型，甚者直接细胞书写（DCW）创建一个3D 仿生微型器官，这在体外建模和高通量药物筛选中具有深刻的意义[5-8]。这些小型化系统已成为极具吸引力的组织工程和药筛的应用程序[9]。体外系统的3D 生物打印可以模拟制造出复杂的仿生器官和生理反应模型，并通过精确地操控细胞和它们的微环境来测试药物，它将更容易将机械和电子元件、数字芯片结合，以便商业化的自动大规模生产[10]。药物筛选模型的制备就是应用特定的生物墨水，通过排列组合或者相应影响因素的作用下，打印出直接或间接的生理、病理模型，用于研究在复杂环境下干细胞的分化和高通量药物筛选测试[11,12]。

1 生物墨水、生物打印方式的探索研究

提到3D 生物打印模型平台建立的过程，就不得不提生物墨水，生物墨水通常由细胞、聚合物和添加剂组成的细胞悬浮溶液。目前可应用于有效3D 打印的生物墨水相对匮乏，仍然是制约3D 生物打印快速发展的瓶颈，因此，在开发用于3D 生物打印的生物墨水方面同样有大量工作要做。目前常用的生物墨水主要有细胞聚集物（组织球体、细胞颗粒和组织链）、微载体、脱细胞基质成分、纤维蛋白、胶原、透明质酸、聚己内酯、聚乙二醇、各种类型水凝胶、藻酸盐等，虽然其通用性优良，但是针对特定细胞并诱导分化还相对局限[13-24]。目前3D 生物打印有两种方式，分别为基于支架的生物打印和无支架的生物打印。支架生物打印在药物的传递研究及干细胞生物打印中是首选方法，目前常用的支架材料包括脱细胞的细胞外基质和大量的天然或合成聚合物，具有广泛的机械、生物相容性。LEE H 等人开发了一种用于3D 生物打印的肝脏脱细胞细胞外基质（dECM）的生物墨水，并评估了其特性：通过适当的印刷参数，验证印刷过程的通用性和保真度；还评估了肝dECM 生物墨水与商业胶原生物墨水的干细胞分化和HepG2 细胞功能，发现肝dECM 生物墨水可诱导干细胞分化并增强HepG2细胞功能；因此，其所提出的肝脏dECM 生物墨水是一种更好的选择[25]。Zhang B 等人提出了一种通过3D 打印方法构建新型琼脂糖3D 培养凹面微孔阵列的方法，以聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜为桥，制备出琼脂糖膜，并用于肝细胞球体的形成，得到的共形成肝细胞球体保持了高活性和稳定的肝特异性功能，这种工程琼脂糖凹面微孔阵列是形成生物肝支持元件的潜在有用工具；它不仅可以应用于人体器官损伤的治疗，还将用于疾病模型和药物筛选模型的开发[26]。除了上述有支架的生物打印方式外，还有无支架的生物打印，细胞可以在不使用任何外源性结构的情况下增殖，在这种模式下，细胞通过钙粘蛋白介导的粘附进行自组装，从而形成3D结构[27,28]。生物墨水及打印方式等的研发是当下的研究热点，是3D 生物打印建立高通量药筛平台的基础，未来研究人员将会研制出更多更好的生物墨水材料和打印方式应用于各学科的研究工作。

2 各学科3D打印药筛模型平台建立的探索和应用

2.1 血管领域

血管的3D 生物打印是体外重建有功能的人造组织或器官的重要的一环。作为概念验证，早在2012年，XU C 等人通过3D 喷墨生物打印成功地打印出具有悬垂结构的成纤维细胞基管，采用此法可以在无支架的条件下制作管状悬挑结构，通过优化印刷条件，即使在72 h 的温育期之后，发现成纤维细胞存活率达82%以上（控制效果好的话可达93%），由此衍生出来的制作理念方法有助于进一步研究打印几何形状更加复杂的组织工程血管，其前景巨大[29]。开发用于药物筛选的仿生3D 组织结构，工程血管应被整合到所打印结构中以模仿药物给药过程，可灌注的血管化3D组织结构的仍然是一个热点研究领域，HASAN A 等人介绍了一种利用光交联明胶水凝胶在微流控平台上制备三层仿生血管样结构的新方法，血管的直径、血管壁的总厚度和壁的每个单独层的厚度是独立控制的，这种制造工艺简单而快速，允许在几分钟内3D 打印制造血管结构，并且在3-5 d 内在血管内形成血管内皮细胞层，所制备的血管构建体可潜在地用于许多应用，包括药物筛选、心血管疾病或癌症转移的体外模型的开发以及血管生物学和机械生物学的研究[30]。不仅对血管的管状结构进行生物打印重建，HORVáTH L等人还利用3D 生物打印技术对由内皮细胞、基膜和上皮细胞层组成的人空气-血液组织屏障的类似物进行生物制造，该技术能够自动重复地产生更薄和更均匀的细胞层，这是所需的最佳空气-血液组织屏障，用于安全评估和药物功效测试的高通量筛选，甚者这一生物打印平台将为设计制造先进的3D 肺模型提供了一个极好的工具[31]。

2.2 肿瘤领域

在过去，候选药物是使用2D 培养的肿瘤细胞和动物模型来评估的，尽管临床应用前的测试取得成功，但是进入临床试验的大多数药物还是以失败而告终，高失败率主要是由于当前模型的反应与人的反应并不匹配，而通过3D 打印建立高通量药筛平台的是未来抗癌药物研发的重要发展方向。PARK T 等人通过喷墨打印在成纤维细胞层纳米纤维膜上连续沉积胶原悬浮的Hela 细胞，制造了多孔形式的肿瘤微组织阵列，基质金属蛋白酶2 和基质金属蛋白酶9 在肿瘤微阵列中的表达均高于无纤维母细胞微组织，用抗癌药物处理制备的微组织，癌症微组织对阿霉素的发生高耐药，而无纤维母细胞微组织却没有发生耐药，提示3D肿瘤微组织阵列可用于早期药物筛选和3D肿瘤模型研究[32]。HAM S 等人以聚合物双水相体系为基础，将密度较大的水相与所需密度的癌细胞混合，使用3D 打印机，将一滴该细胞悬浮液分配到含有第二浸渍水相的384 微孔板的每个孔中，癌细胞保留在井底的水滴中，并在孵化过程中形成球体，打印机的使用确保了单个液滴的精确分配，从而在每个孔中形成单个尺寸均匀的球体；用标准的化疗化合物阿霉素处理乳腺癌细胞球状体的实验研究证明了这种方法在高通量药物筛选中的潜力；与现有方法相比，这种球状体培养微技术呈现出绝对的优势，例如药物和活性试剂的添加显得非常容易，能够在不将球状体转移到新平板上的情况下分析球状体，以及不需要专门的平板或装置来形成球状体[33]。多形性胶质母细胞瘤（GBM）是人类原发性脑癌中最常见、最恶性的肿瘤，药物治疗仍然是最有效的治疗方法之一，FAN Y 等人开发了一种由可光聚合的聚乙二醇二丙烯酸酯组成的水凝胶，通过快速光刻生产，在其中培养胶质母细胞瘤细胞（U87），最后在芯片上形成3D 脑癌组织；并使用该GBM 芯片进行匹伐他汀和伊立替康的联合治疗，结果表明，该芯片可有效形成GBM 肿瘤球体，具备多次同时给药和高通量药物测试的能力，有望成为一个强大平台[34]。这些方法不仅应用在抗癌药物的研发领域，还有望推广用于其他临床研究，加快新药的研发。

2.3 肝脏领域

目前在肝脏生理、病理模型建立的研究领域里，通过3D 打印建立模型平台的案例越来越多，这也为其他学科模型平台的建立提供了有益参考。肝脏作为人体的重要器官，在人体中起着重要作用；临床治疗中由于药物导致肝损伤的高发，因此对于药物研发中的肝毒性检测尤为重要，在2016 年KNOWLTON S等人报道建立了一种可用于肝毒性检测的肝组织模型，该模型是通过3D 打印微流控装置将肝球体封装在水凝胶支架中并用于药物肝脏毒性的检测[35]。TOURLOMOUSIS F 等人首次提出将水凝胶封装的肝细胞3D 打印到微通道的图案化的阵列中，使其精确地嵌入到三维动态微器官装置，灌注药物通过肝细胞进行生物转化，经过计算等验证机械传导数据、确定流出药物和其代谢的分布[36]。虽然上述实验只是3D打印肝模型有效性的研究和尝试，但是这已经大大简化了在芯片上器官模型的制造过程。由于肝衰竭和药物性肝损伤后供肝不足，许多研究集中在开发供肝替代物和供肝体外模型，用于移植和药物筛选。尽管已经进行了一些研究，但是这些模型还不能完全模拟肝脏的复杂性，从肝脏分离出的原代肝细胞与体内天然肝细胞非常相似，但它们在2D 培养中寿命有限，尽管可以使用夹层培养物和间充质干细胞（MSCs）延长其寿命，但是它不能完全再现体内结构；此外，长时间的2D 培养导致细胞缺氧死亡；而3D 生物打印技术已经成为克服这一限制的创新技术之一。KIM Y等人尝试先从6-8 周龄小鼠肝脏中分离小鼠原代肝细胞，利用3D生物打印系统制作细胞-海藻酸盐结构，结果3D打印的肝细胞存活达14 d，这个结果使得3D生物印刷技术可用于原代肝细胞的长期培养以用于药物筛选，并将成为生产人造肝脏的潜在方法；之后他们更进一步尝试使用人原代肝细胞和间充质干细胞（MSCs）的藻酸盐水凝胶的3D 打印技术，分离的肝细胞存活率在90%以上，细胞存活7 d，在MSCs作用下，3D肝脏结构没有形态学变化，这些结果表明，3D 生物打印技术和MSCs 分泌的旁分泌分子都支持肝细胞的长期培养，而不会造成细胞形态学变化，因此，这种技术允许细胞在形成多细胞聚集体的同时广泛扩增，可以应用于药物筛选，并且成为开发人造肝脏的有效方法[37,38]。另外有报道称也可以通过水凝胶的不同形态和空间结构将人脐静脉内皮细胞和脂肪源间充质干细胞通过3D 打印技术嵌入其中，研究者发现其具备更加完善的形态学组织、更高的肝特异性基因表达水平、增加的代谢产物分泌和增强的细胞色素P450诱导，从而使得3D 仿生肝脏模型得以开发出来，该模型同样再现了天然肝脏模块结构，可用于早期药物筛选和疾病建模[39]。此外，在肝脏疾病模型的建立的研究中，ORTEGA-PRIETO A 等人撰文描述了一个3D 微流体原代人肝细胞系统允许乙型肝炎病毒（HBV）感染，并可以保持至少40 d。该系统能够对HBV 生命周期的所有步骤进行概括，从而为HBV 研究提供了一个有价值的临床前平台[40]。

2.4 肾脏领域

生物打印的肝脏模型和肾脏模型对于制药行业都具有极大的商业价值。亚毫米级流体系统“芯片肾”平台的发展，不仅能够体外再现肾脏功能，还将会对生物医学领域产生影响深远，包括药物筛选、细胞和组织工程、毒性测试和疾病建模，SOCHOL R 等人论述了3D 生物打印“芯片肾”平台和最先进的亚毫米级3D打印方法发展的最新进展，重点是生物物理和建造能力，并讨论了基于3D 打印的方法扩展“芯片肾”系统功效的潜力[41]。HOMAN K 等人报告了一种用于创建体外人肾近曲小管的3D 生物打印方法，将其完全嵌入在细胞外基质中，并安置在可灌注的组织芯片中，可维持超过两个月，这种芯片上的3D 近曲小管相对于2D 控件上生长的相同细胞，它的上皮形态和功能特性均显著增强，当加入肾毒素环孢素A 达到一定剂量时，上皮屏障则被破坏。3D生物打印方法具备按需编程制造先进的人体肾组织模型的潜力[42]。目前在肾脏领域3D 生物打印还有待科研人员继续探索并深入研究。

2.5 心脏领域

由于天然心肌的层次结构，心脏组织和器官模型的构建仍然是一个巨大的挑战。整合血管的需求也带来了更大的复杂性，限制了现有的可用于合成心血管器官的方法，通过探索，ZHANG Y 提出了一种新的基于3D 生物打印的混合策略，以制造内皮化心肌，通过使用自制特定的复合生物墨水，内皮细胞在微纤维水凝胶支架内直接活剥，逐渐向微纤维边缘转移，形成一层融合的内皮，之后在三维内皮细胞床上植入心肌细胞，生成能够自发和同步收缩的排列整齐的心肌；他们进一步将这些有机化合物嵌入到一个特别设计的微流体灌注生物反应器中，以完成内皮化-心肌的心血管评估平台，通过该技术可以构建内皮化的人心肌；3D生物打印内皮化有机化合物技术可能在再生医学、药物筛选和疾病建模中得到广泛应用[43]。为了更好地对药物反应进行全面评估，建立多个器官模型如心-肝-肾模型，来创建出更接近人体实际的具有预测性的微型化人体的平台，该平台甚至有可能成为代替临床前动物实验的最佳平台。

2.6 骨科领域

由于全球人口的老龄化，骨病发病率急剧上升。骨缺损、骨折和骨坏死导致患者生活质量下降。自体骨、异体骨、异种骨及生物型假体已经被用于克服不同类型的骨缺损及假体置换手术，尽管被广泛使用，但是假体耐久度相对较短，免疫排斥或植入失败也很常见，需要开发新的骨替代物。Correia T 等人使用计算机辅助设计模型或医学数据，通过3D 打印快速原型技术来制造3D 磷酸三钙/海藻酸钠支架，直接加入银纳米颗粒制备的复合支架具有良好的力学性能、生物相容性和杀菌活性，是目前最适合用于骨组织再生的复合支架[44]。在临床上，污染或感染导致的骨缺损的治疗非常棘手，而具有骨应力传导和抗菌性能的骨替代物代表了更先进的治疗策略，YANG Y 等人研究将季铵盐壳聚糖（羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，HACC）植入到由聚乳酸-聚乙交酯和羟基磷灰石（HA）组成的3D 打印支架上，发现所合成的复合支架在体外和体内条件下均能降低细菌粘附和生物膜形成，支架上固定HACC可以有效地破坏微生物膜，使用的人骨髓间充质干细胞，更有利于细胞附着、增殖、扩散和成骨分化，并通过动物实验进行生物相容性实验，发现HA 结合支架具有良好的新生血管形成和组织整合能力，在治疗骨感染的临床应用上具有良好前景，显示出显著增强的抗菌活性，特别是对耐抗生素菌株的抗菌活性，以及良好的成骨活性和生物相容性，为临床治疗感染性骨缺损提供了一种有效的多孔复合支架[45]。目前骨科领域的3D 生物打印技术还多停留在骨替代物、假体的制造上，而对于骨科领域血管化仿生关节及常见慢性筋骨病、风湿及类风湿性关节炎等疾病的3D 打印药筛平台的设计制造目前尚无报道，这也将是今后重点研究的新领域。

3 中医药现代化研究

3D 生物打印技术作为新兴技术在中医药研究领域目前尚无文献报道，该技术在自动化、高通量、精确的空间控制以及协同培养和分层结构制造等方面具有无可比拟的优势。可以预见的是通过3D 生物打印技术，我们将可以快速、精确、廉价的制造出各种高通量药物筛选平台，大大降低3D 体外系统建立的时间及经济成本。样品是高通量药物筛选的物质基础，中医药就是这个大规模的样品库，将这些各学科领域成熟的高通量药物筛选平台用于中药活性成分研究与发现、中药单体研究及大规模筛选、中药复方作用机理的研究以及中医疾病治疗的机制研究等方面，具有广阔的应用前景。

我们知道整体观念是中医学的重要思想，认为人是一个有机整体，构成人体的各组成部分之间结构上不可分割，功能上相互协调补充，病理上又相互影响；为了能够更加准确地模拟预测人体内药物的有效性和安全性，体外仿生系统的开发势在必行；芯片上的器官系统是微型化的微流体三维人体组织和器官模型，其设计目的是再现其体内对应的重要生物和生理参数，这些具有仿生组成、结构和功能的体外模型极有可能取代传统的2D 静态细胞培养，弥合目前临床前动物模型和人体之间的差距。如前所述，多个3D生物打印类器官模型可以通过微流体系统连接在一起，以类似体内的方式排列，并且通过一个完全集成的模块化物理、生化和光学传感平台，该平台通过一个流体路由试验板，持续、动态和自动化的方式运行芯片上的有机单元，并具有分析多器官相互作用的能力，为目前的芯片上器官模型在药物筛选中的性能提升铺平了道路，通过集成大量实时传感器实现生物物理和生化参数的自动化现场持续监测[46]。这样的整合平台更加接近于人体的实际状态，更能符合中医药学整体观念，通过这些整合平台得到的实验数据也将更加接近于人体实验。3D 生物打印技术将会为中医药现代化研究提供了良好的条件，应用这些新技术、新方法，必将对中医药现代化研究起到积极的推动作用。

4 评价及展望

3D生物打印技术作为数字化技术的集中体现，科研人员通过利用医学影像学图像数据分析建立数据库，再根据这些数据，打印制造出符合人体解剖学特点的3D 组织结构，在建立生理、病理体外模型和高通量药物筛选模型中前景广阔。与传统的生物制造方法相比，3D 生物打印技术适用于细胞的共培养，细胞和生物结构的精准仿生构造，血管化仿生组织的建立，高通量制造和高度自动化的分层制造等领域。经过上述大量文献的回顾学习，我们认识到除了目前在临床应用领域常见的术前规划，术中导航及骨组织工程设计制造外，3D生物打印技术还将在建立体外模型和高通量药物筛选模型领域广泛应用；3D打印应用于高通量药物筛选作为当前新药发现的手段具有选择范围广、筛选成本较低、结果可靠等特点，是新药研究的重要手段；特别是在中医中药领域，它可以加快中医中药的深入研究，利于发现中医中药在疾病治疗过程中的作用机制，必将对中医药现代化研究起到积极的推动作用。通过3D 打印高通量药物筛选的方法，可以发现更多临床效果好，应用价值高，具有独立知识产权的创新药物。当然，虽然3D 生物打印的优势凸显，但是目前仍然缺乏有说服力的产品，还需要更多的证据来证实其构造出的模型在药物的研究中具备和动物体内的一致性；甚至在病理模型的制备或直接打印都还有待进一步研究，同时打印设备、打印墨水以及打印方式的研发还有很长的路要走。