陆俊强

（相城区农业局阳澄湖动物防疫站，江苏苏州 215100）

猪丹毒（Swine Erysipelas，ES）也叫钻石皮肤病（diamond skin disease）或红热病（red fever），是由红斑毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）引起的一种急性、热性传染病[1]。

1 材料

2019年3月常熟某养殖场新引进母猪10头和育肥猪50头，饲养2月左右，有4只猪不表现任何临床症状而突然死亡，送检病猪1例，该病猪体温升高至41℃，精神萎糜，喜卧地，食欲时好时坏，被毛无光，贫血下痢，背上还有红斑。剖检后可见全身皮下脂肪及筋膜严重黄染，腹股沟淋巴结肿大，周边出血，心包积液，心肌出血，肺充血、水肿，肝肿大，局部郁血，胆囊萎缩，肾皮质有较多出血点，膀胱点状出血，肠系淋巴结肿大并周边出血，胃底大面积出血，盲肠出血，疑似猪丹毒病例。分别对病猪的肝、脾、肾进行了采样，作为实验材料以备使用。

2 方法

2.1 细菌的分离

用接种环从该病猪肝、脾、肾无污染采集细菌，分别接种于血清营养琼脂平板上，置37℃的恒温箱培养24h。培养基按常规方法配制。

2.2 细菌的纯化

从血清营养琼脂平板上挑取三株分离菌的单一菌落，分别接种于新的血清营养琼脂平板上做纯培养，置37℃的温箱培养24h，观察三株细菌的形态区别及生长情况。

2.3 染色镜检

取半玻耳的生理盐水于一玻片上，无菌挑取纯培养血清琼脂平板上的可疑菌落于生理盐水中涂布均匀（大概直径0.5cm），自然干燥，将干燥好的抹片，涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热进行固定。做革兰氏染色，先用结晶紫染色1min20s，水洗，用碘液媒染1min20s，水洗，用酒精脱碘25s，水洗，用复红复染1min40s，水洗，用压片纸压干，油镜镜检。

2.4 16SrRNA基因测序法

挑取2.2中纯化的单个菌落加入10μl的16S-free H2O中，煮沸10min后，离心取上清，按照16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit（宝生生物工程（大连）有限公司）方法操作，PCR扩增出1个产物，经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，用Agarose Gel DNA Extraction Kit（Roche公司）回收，回收产物由金斯瑞生物科技进行测序。

2.5 生化试验

分别挑取纯培养血清琼脂平板上的菌落，接种于尿素、甘露糖、棉籽糖、果糖、乳糖、枸橼酸盐、甘露醇、山梨醇、麦芽糖、卫茅醇、蔗糖、阿拉伯糖、木糖、侧金盏花醇、半固体琼脂（动力）、苯丙氨酸、硝酸盐还原、蛋白胨水（靛基质）、赖氨酸、鸟氨酸、氨对、硫化氢、葡萄糖（产气）、葡萄糖酸盐24种微量发酵管中，37℃培养24～48h，分别观察微量发酵管的颜色变化及产生气体情况。根据结果进行细菌种属判定[2]。

3 结果

3.1 细菌分离结果

在血清琼脂培养基上经过37℃培养24h后能够生长，长出纤细、针尖大、露珠样、透明、表面光滑、边缘整齐小菌落，直径小于1mm。

3.2 镜检结果

分离菌涂片经革兰氏染色，镜检可见紫色、细长呈直或稍弯的杆状，以单个或短链存在，长约1～3μm宽约0.2～0.4μm，单在、成对或成丛排列，无运动性，无孢，革兰氏阳性，符合猪丹毒杆菌的形态特点。

3.3 16SrRNA基因测序法结果

模板DNA后，经PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，60min后，结果显示检测样品扩增出500bp的条带，用Agarose Gel DNA Extraction Kit（Roche公司）回收，回收产物由金斯瑞生物科技进行测序。通过因特网在NCBI 的Blast（http：/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/）中对分离菌株测序结果进行检索，结果为猪丹毒杆菌。

3.4 生化试验结果

三组分离菌株的生化试验结果基本一致，除了棉籽糖在做肾脏分离菌株时受到干扰而造成了一些偏差。分离菌株对赖氨酸、鸟氨酸、氨基酸对照均为阴性；能够发酵甘露糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖，不能发酵棉籽糖、阿拉伯糖、木糖；对醇类物质没有反应；不分解尿素；不能在半固体琼脂中生长；不还原硝酸盐为亚硝酸盐；不产生靛基质；硫化氢反应阳性；与枸缘酸盐、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐均不反应。

4 讨论与小结

该菌株接种血清营养琼脂平板37℃培养24h后，长出纤细、针尖大、露珠样、透明、表面光滑、边缘整齐小菌落，革兰氏染色镜检结果为阳性短杆菌，以单个或短链排列，与猪丹毒杆菌的形态学特征一致，同时通过16SrRNA基因测序法结果和生化鉴定结果判定分离菌为丹毒杆菌。当下，仅仅依靠某种药物治疗猪丹毒杆菌已很困难，必须采取综合的防制措施。因此，在治疗本病时，要注意科学合理用药，实行交替用药和配合用药。有条件的最好先进行药敏试验，筛选出高效敏感的药物进行治疗，以提高对本病的治愈率。同时夏秋天切断其传播途径，加强管理，消灭吸血昆虫，改善猪舍环境也是必不可少的