闫文超 黄峰

摘 要：用分子层析的方法，对19株木腐真菌在特定的培养基中生长繁殖后所得的胞外培养液进行了分离及漆酶和PO activity 测定。发现，胞外具有酚氧化酶活性的小分子物质在所有产漆酶的白腐菌中具有普遍性，推测这种小分子物质在木质素生物降解过程中发挥着一定的作用。

关键词：白腐菌，漆酶，酚氧化酶活性，小分子物质

对木纤物质表面结构研究显示，目前发现的主要木质素降解酶如木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（laccase）等酶分子尺寸均大于木纤物质表面微孔孔径，因而难以渗透并与内部木质素接触[1-2]。单独的大分子酶类不能构成完整的木质素降解系统，必须有一些小分子活性物质的参与才能完成对木质素的自然降解过程。将培养液用膜过滤以除去菌丝，发现滤液能使硫酸盐浆脱除木质素[3]，表明真菌与纤维的接触不是必须的，真菌在生长过程中产生的氧化酶类和其它物质共同导致了一个缓慢的、连续的木质素降解过程。

作者通过对一株白腐菌的研究发现，白腐菌在生长过程中，会产生一种小分子物质。这种小分子物质，除能产生羟自由基，能络合铁，能还原三价铁为二价铁外，还具有类似于酚氧化酶的活性，推测这种小分子物质在木质素降解过程中起着重要作用[4]。但是这种胞外具有类酚氧化酶的活性小分子物质在白腐菌中是否具有普遍性，值得深入研究。

一、材料与方法

（一）菌种

本研究采用菌种部份为实验室自行筛选所得，部份为实验室原有菌株。基本情况如下表所示。

（二）培养基及培养条件

适量麸皮及木粉，煮沸30分钟，过滤后倒入300mL三角瓶中，接种后放于30℃摇床上培养。

（三）培养液提取及其成分分离

各菌培养一定时间后，将培养液离心取上清酶液放于0℃冷藏备用。以20mM pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液对各菌酶液进行Sephadex G25分子筛层析，对层析液进行分步收集。对每管收集液进行漆酶及PO activity 测定。

（四）漆酶的测定

以2，6-DMP（2，6-二甲基酚）为底物，2mL pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，20mmol/L的2，6-DMP 50uL，酶液适量。30℃下检测470nm处的吸收变化。消光系数ε=49600 mol-1Lcm-1 。以每分钟转化1umol底物定义为一个酶活单位。

（五）胞外小分子物质PO activity检测方法

取样品1mL及10mM 2，6-DMP1mL，测反应混合液在470nm处的吸光值变化。

二、结果与讨论

实验结果如表2所示，我们发现，在杏鲍菇、LG9、LG6、Lentinus lepideus、红柄牛肝菌、BYBF、YDHSD2、Gloeophyllum saepiarium、真姬等这些真菌的Sephadex G25层析液中，都有具有PO活性的小分子物质存在。如图1～所示，各图中，系列1中的第一个峰与系列2中的第一个PO活性峰相对应，即为漆酶峰，系列2中其它几个PO活性峰则是小分子物质的作用结果。

三、结论

以上结果表明，凡产漆酶的菌，均产具有酚氧化酶的活性小分子物质。而不产漆酶的菌，则都不产此种小分子物质。说明具有酚氧化酶活性的小分子物质在产漆酶的白腐中具有一定的普遍性。同时也可以推测，这种胞外的小分子物质在木质素生物降解过程中发挥着一定的作用，值得进一步深入研究。

系列1：酶液G-25层析图谱  系列2：氧化DMP活性曲线

系列1：酶液G-25层析图谱

系列2：氧化DMP活性曲线

系列1：酶液G-25层析图谱

系列2：氧化DMP活性曲线（不含漆酶峰）

参考文献

[1] Flournoy， D.S.， Kirk， T.K. and Highley， T.L. Wood decay by brown-rot fungi： changes in pore structure and cell wall volume [J]. Holzforschung， 1991， 45： 383-388.

[2] Flournoy， D.S.， Paul， J.A.， Kirk， T.K. et al.， Changes in the size and volume pores of sweet gum wood during simultaneous rot by Phanerochaete chrysosporium [J]. Holzforschung， 1993， 47： 297-301.

[3] 闫文超，黄峰，高培基等.对白腐菌胞外小分子物质的初步研究[J].中国造纸学报，2003，18（2）：47-50.

基金项目：本项目为国家自然科学基金资助项目（30170027），同时获得教育部全国优秀博士学位论文作者专项资金资助（200023）和华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室资助。

作者簡介：闫文超（1979.06- ），男，汉族，贵州贵阳人，硕士研究生，副教授，研究方向：微生物。