杨蕾 杨海健 李勋兰 杨波华 洪林 张云贵

摘要 ：本文利用Illumina Miseq高通量测序技术对重庆地区有青苔病症和无病症的柑橘叶际真核生物的群落组成、结构、多样性及差异进行了研究，旨在找到可能的病原物类群，为更好地防治柑橘青苔病奠定基础。结果表明13个柑橘叶片样本共检测到303个OTU，多样性较为丰富;优势门为链形植物门Streptophyta、子囊菌门Ascomycota、绿藻门Chlorophyta等;通过分析发现可能的病原物为不可培养的虚幻球藻属球藻uncultured Apatococcus sp.、黄绿异小球藻Heterochlorella luteoviridis、无柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡胶藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、椭圆球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola等;不同区县表现出青苔病症状的柑橘叶片上疑似病原物的種类和丰度都差异很大。柑橘青苔病可能是由多种藻类及真菌复合侵染造成的，病原物和柑橘叶片间的相互作用有待进一步研究。

关键词 ：柑橘; 青苔病; 高通量测序; 病原; 多样性

中图分类号：

S436.66

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018434

Influence of moss disease on the biodiversity of phyllosphere

microbe on citrus leaves

YANG Lei1， YANG Haijian1， LI Xunlan1， YANG Bohua2， HONG Lin1， ZHANG Yungui1

（1. Fruit Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 401329， China;

2. Maize Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 401329， China）

Abstract

The eukaryotic diversity of citrus phyllosphere microbe communities after moss infection in Chongqing was analyzed to find the possible pathogens， and to lay the foundation for better controlling citrus moss disease. In this paper， Illumina Miseq high throughput sequencing technology was used to explore the differences of eukaryotic composition and structure community between having symptoms samples and no symptoms samples in Chongqing. 303 OTU were detected from 13 citrus leaves samples， and the diversity of samples was abundant. The results showed that the advantage phylum were Streptophyta， Ascomycota， and Chlorophyta. The advantage classes were Dothideomycetes， Trebouxiophyceae， Eurotiomycetes， Sordariomycetes. The possible pathogens were uncultured Apatococcus sp.， Heterochlorella luteoviridis， Cyphellophora sessilis， Heveochlorella hainangensis， Coniochaetales sp. GMG C4， Chloroidium ellipsoideum and Kalinella bambusicola etc. The species and abundance of suspected pathogens varied widely. The occurrence of citrus moss disease may be caused by a variety of algae and fungal complex infection， the interaction between pathogen and citrus leaves remains to be further studied.

Key words

citrus; moss disease; high throughput sequencing; pathogen; diversity

1981年 Blakeman 首次将寄生在植物叶片表面的微生物定义为叶际微生物[12]。由于叶、茎、花、果等植物地上部分的环境条件一致，人们普遍认为叶际是指维管植物地上部分的表面和内部。地球上植物的叶面面积大概为十亿平方公里[3]，与根际环境相比，叶际环境的营养物质和水资源相对匮乏，且面临着紫外线照射、温差过大和存在活性氧等不利于微生物生长的严苛条件。即便如此，叶际微生物的组成仍然十分丰富且复杂，不同物种有着不同的微生物群落[45]，包括细菌、真菌和原生生物等。叶际微生物在农业生态系统中也扮演着重要角色，叶际微生物之间的互作可以影响植株的健康与生长，以及农作物的产量[67]。然而，农业生态系统中关于非病原微生物的定殖和病原微生物的相互作用以及单个菌株对微生物群落影响等方面的研究较少。目前，在农业生态系统中很少有运用高通量测序技术研究作物叶际微生物病原菌相互作用的报道。

重庆地区高温多雨、温暖湿润，有利于柑橘生长的同时也有利于病害的发生;另一方面，柑橘属于常绿树种，通常长势较旺，枝叶繁茂，郁闭度较高，这也为柑橘病害的发生提供了良好的条件。其中柑橘青苔病就是一种受潮湿多雨气候影响甚重的病害。在我国南方的多雨季节，在一些通风不良的柑橘果园，经常能见到树干、枝叶甚至地面上布满青苔，严重阻碍树体光合作用，进而影响果实外观品质。目前国内外学者对柑橘青苔病的研究报道很少，对其病因、病原特性及防治方法等尚未形成系统科学的研究体系。为了探寻不同区域条件下有青苔病症和无病症柑橘叶片叶际真核生物群落多样性和群落结构的差异，分析可能的侵染柑橘的青苔病原种类，我们通过高通量测序的方法对重庆3个区县柑橘叶片进行了叶际真核生物多样性分析，以期确定柑橘青苔病的病原，并为柑橘青苔病的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料和采样地点

在重庆奉节、开州、忠县3个区县选择管理水平相似、海拔水平相近的5个果园采集样品。柑橘品种为‘W·默科特[8]。采样方法为：在每个果园东南西北中5个方位各选择1棵样树，在每棵样树上随机挑选有青苔病症和无青苔病症的叶片各9片，即1份样品45片柑橘叶片。共采集13份，样品信息见表1。

1.2 真核生物基因组 DNA的提取及质量检测

柑橘叶表的真核生物基因组DNA采用FastDNATM SPIN Kit for soil进行提取，用Nanodrop 2000检测基因组 DNA质量。浓度≥10 ng/μL，总量≥500 ng，纯度OD260/280=1.7～2.0的DNA可用于后续试验。取3 μL DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性。检测电压为120 V，电泳时间约为20 min。

1.3 高通量测序及数据分析

1.3.1 真核生物 DNA的提取和扩增

以3个不同区县采集的13份柑橘叶片DNA原液作为PCR模板，对其18S rRNA V4 区进行高保真PCR扩增，设置3个重复试验，同时以标准的真菌/真菌基因组DNA Mix作为阳性对照。扩增引物根据选定的检测区域确定，Primer F=Illumina adapter sequence1+TTGGYRAATGCTTTCGC，Primer R=Illumina adapter sequence 2+CGCGGTAATTCCAGCTCCA。PCR扩增程序为：94℃预变性2 min;94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，25个循环;最后在72℃下延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物是否单一和特异。将同一个样本的3个平行扩增产物混合，每个样品加入等体积的Agencourt AMPure XP核酸纯化磁珠进行纯化。委托上海天昊生物科技有限公司进行 Illumina MiSeq[9]高通量测序。

1.3.2 DNA文库的建立及上机测序

利用带有Index序列的引物，通过高保真PCR向文库末端引入特异性标签序列。反应采用8个循环的PCR程序。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，应用核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化，得到一个样本的原始文库。

根据琼脂糖凝胶电泳的初步定量结果，对已经带有各自Index标签的样本文库浓度进行适当稀释，再利用Qubit对文库进行精确定量，根据不同样品的测序通量要求，按相应比例（摩尔比）混合样品。对于混样后的文库采用Agilent 2100 Bioanalyzer检验测序文库插入片段的大小，确认在120～200 bp之间无非特异性扩增，并准确测定测序文库浓度。采用Miseq平台2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序，最后对测序结果进行生物信息学分析。

1.3.3 OTU 聚类分析及注释

运用USEARCH软件合并序列长度和碱基组成完全一致的序列即重复序列，并去除singleton序列（只出现一次的序列），提取非重复序列以备后续分析。根据重复序列条数进行排序，使用UPARSE聚类方法将经过质控后的序列按序列间97%的相似性归并到一个操作分类单元（operational taxonomic units， OTU）。OTU是在系统发生学研究或群体遗传学研究中为便于分析而人为设置的分类单元标志，简单地说，OTU类似于种，是根据高变区序列比对得出的，一般相似度大于97%或95%的序列称为同一个OTU[10]。OTU聚类的同时去除Chimera序列，以备后续OTU分类注释。由于每个样本对应的reads数量差距较大，为避免因样品数据大小不同而造成分析时的偏差，在样品达到足够测序深度的情况下，需对每个样品进行随机抽平处理，获得统一的基数（一般选择测序样本中最小测序reads数为基数），从而准确预测OTU的丰度。使用Mothur[11]软件的classify.seqs命令，与SILVA数据库进行比对，找出与OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物种信息用于OTU的注释。

1.3.4 多样性及群落结构分析

根据OTU列表中的供试样品物种丰度，应用软件Mothur中的summary.single命令，计算种群丰富度指数Chao 1指数[12]和ACE指数[13]，计算群落多样性指数Shannon指数[14]、Simpson指数[15]、InvSimpson指数和用来评估样本序列覆盖度的Coverage指数[16]。

1.4 序列数据处理与统计分析

首先使用FastQC评估原始数据的质量指标，通过FASTX Toolkit对数据进行质量控制，剔除未识别碱基和低质量序列。然后使用Flash程序（version 1.0.0）进行拼接，通过引物barcode（标记），使用FASTX Toolkit软件进行混合样品的分离。使用U Chime （version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。计算DNA矩阵，调用UPARSE程序，在97%的序列相似度水平下对序列进行OTU划分。RDP Classifer软件分析的置信度参数设置为50%。用R语言vegan程序包完成多样性分析。

所得数据用平均值和标准误表示，采用IBM SPSS Statics 20软件对所测数据进行单因素方差分析，并应用Duncan氏新复极差法对不同处理间的差异显著性进行检验，P值小于0.05被认为具有显著差异。

2 结果与分析

2.1 柑橘叶际真核生物群落基本组成

13份柑橘叶片样品经处理后共获得1 546 363条高质量序列片段，总碱基数为533 739 196个，平均长度为345.16 bp，共检测到303个OTU。在生物多样性和群落调查中，稀释曲线（Rarefaction curve）被广泛用于判断样品量是否充分，并用以估计物种丰富度。从图1可以看出，13份样品对应的稀释曲线均基本趋于平缓，说明取样基本合理，实际环境中真核生物群落结构的置信度较高，能够比较真实地反映出样品的群落组成情况。从物种注释统计表（表2）可以看出，通过计算不同分类水平上的类型，样品C2组鉴定到的真核生物类型最多，有133个门，118个纲和98个目，66个科，81个属，70个种。虽然其他组的物种类型没有C2组丰富，但均维持在丰富度较高的水平。

1） A1～A2： 奉节康乐镇铁福村有病症组和无病症组; B1 1～B1 2： 开州丰乐镇黄陵村有病症组; B2： 开州丰乐镇黄陵村无病症组; C1 1～ C1 2： 开州竹溪镇白云村有病症组; C2： 开州竹溪镇白云村无病症组; D1 1～D1 2： 开州竹溪镇青吉村有病症组; D2： 开州竹溪镇青吉村无病症组; E1～ E2： 忠县新立镇桂花村有病症组和无病症组。下同。

A1 and A2： Sample groups with and without symptoms from Tiefu village， Kangle town， Fengjie county; B1 1 and B1 2： Sample groups with symptoms from Huangling village， Fengle town， Kaizhou district; B2： Asymptomatic sample group from Huangling village， Fengle town， Kaizhou district; C1 1 and C1 2： Sample groups with symptoms from Baiyun village， Zhuxi town， Kaizhou district; C2： Asymptomatic sample group from Baiyun village， Zhuxi town， Kaizhou district; D1 1 and D1 2： Sample groups with symptoms from Qingji village， Zhuxi town， Kaizhou district; D2： Asymptomatic sample group of Qingji village， Zhuxi town， Kaizhou district; E1 and E2： Sample groups with and without symptoms from Guihua village， Xinli town， Zhongxian county. The same below.

2.2 柑橘叶际真核生物群落结构

通过柑橘叶际微生物样本物种组成图（图2）可以看出不同分类水平上的优势物种。优势门：链形植物门Streptophyta、子囊菌门Ascomycota、绿藻门Chlorophyta和担子菌门Basidiomycota;优势纲：座囊菌纲Dothideomycetes、共球藻纲Trebouxiophyceae、散囊菌纲Eurotiomycetes、子囊菌纲Sordariomycetes等;优势目：煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、刺盾炱目Chaetothyriales、小丛壳目Glomerellales、小球藻目Chlorellales等;优势科：Cladosporiaceae、Phaeosphaeriaceae、Trichomeriaceae、刺壳菌科Chaetothyriaceae、小丛壳科Glomerellaceae等;优势属：枝孢属Cladosporium、Parastagonospora、Knufia、弯梗孢属Camptophora、异小球藻属Heterochlorella等;优势种：多主枝孢Cladosporium herbarum、不可培养的虚幻球藻属球藻uncultured Apatococcus sp.、Parastagonospora venae、Knufia petricola、Camptophora hylomeconis、黄绿异小球藻Heterochlorella luteoviridis、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides等。

2.3 柑橘葉表真核生物多样性分析

2.3.1 Alpha 多样性分析

从表3可以看出，各处理组真菌的Coverage指数都超过了90%，说明在该水平上的测序结果能够反映出所测样本中生物的真实情况。Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数是常用的描述群落物种多样性的Alpha多样性指数，这些指数可以对群落物种组成的丰富度和均匀度进行综合评价，而Shannon指数对物种丰富度更敏感。Chao1数值越高表明群落物种的丰富度越高，Shannon值越大说明群落多样性越高，Simpson指数值越大群落多样性越低[17]。从这些指数可以看出，柑橘叶片真核生物的多样性较为丰富，其中Chao1指数最高和最低的分别是D1 1和A1，Shannon指数最高和最低的分别是C1 1和A2，Simpson指数最高和最低的分别是A2和C1 1。综合这些指数的特征，在13组样品中真核生物丰富度最高的是C1 1组。经方差分析发现，13组样品间的真核生物丰富度及多样性差异显著（P<0.05），说明不同区域有病症和无病症柑橘叶表真核生物的丰富度都较高，且多样性差异明显。

2.3.2 Beta多样性分析

Beta多样性指标用来比较多组样品之间的差异。根据不同的采样地点将样品分为了5组。Venn图可以统计OTU水平中多组样本中共有或独有的物种数目，可以反映各个环境样品在物种组成上的相似性及重叠情况[17]。共同含有的OTU数量越多说明样品间的生物群落组成相似度越高。通过Venn图（图4）可以看出，不同区组柑橘叶表包含共有的真核生物OTU是85个，含有特异OTU个数最多的是E组。

2.3.3 主坐标分析

主坐标分析（principal coordinate analysis， PCoA），是一种基于距离评估数据相似性或差异性的可视化方法，通过对特征值和特征向量进行排序，选择排在前几位的特征值通过PCoA可以观察个体或群体间的差异[18]。在PCoA图中，空间较近的（距离较近的）样本显示样本间的差异较少，反之，若样本间距离较大则样本间的差异性较大。将B1 1、B1 2合并为B1，C1 1、C1 2合并为C1，D1 1、D1 2合并为D1进行分析。从图5可以看出，采集自奉节和忠县的无病症组A2和E2叶片的生物类型较为相似，距离近差异小;A1、B1、B2、C2、D1和E1的距离较近，样品物种组成差异小;C1、D2与上述明显聚在一起的两大类的距离较远，与它们的差异都较大。

2.4 有病症组和无病症组之间生物组成和结构的差异

2.4.1 有病症组和无病症组组成差异分析

将13份样品分为有病症组和无病症组两个组别。除柑橘和无记录的物种外，选择在种水平上相对丰度在前20位的物种绘制柱状图（图6）。各样品群落结构柱状图包含两方面信息：样本所含各分类水平物种和物种的相对丰度。

有病症组中丰度是无病症组的7倍以上的物种有：不可培养的虚幻球藻属球藻uncultured Apatococcus sp.、黄绿异小球藻Heterochlorella luteoviridis、无柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡胶藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、椭圆球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola;有病症组中丰度是无病症组的1～3倍物种有：胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、Vishniacozyma carnescens、Jaminaea angkorensis。由此推测，柑橘青苔病可能的病原为以上10个物种中的一个或多个。在无病症组中的丰度是有病症组3倍以上的物种有：Camptophora hylomeconis、Farysia taiwaniana、Golubevia pallescens、Papiliotrema aurea，这些菌可能是潜在的生防菌株，或是在真核生物与柑橘寄主的互作关系中可发挥重要作用的菌株。

2.4.2 不同区域有病症组病原物组成差异

不同区县有青苔病症状的柑橘叶片上疑似病原物的种类和丰度都差异很大（图7）。在奉节主要的病原为Jaminaea angkorensis和Coniochaetales sp. GMG C4，其中Jaminaea angkorensis所占比例高达91.76%，而黄绿异小球藻Heterochlorella luteoviridis、海南橡胶藻Heveochlorella hainangensis和Kalinella bambusicola这3种可能的病原菌并不包含在奉节采集的有病症柑橘叶片中;与之形成鲜明对比的是采集自忠县的有病症叶片，其病原主要为海南橡胶藻H. hainangensis，其所占比例为35.50%，其次为K. bambusicola、椭圆球藻C. ellipsoideum和无柄杯梗孢C. sessilis，它们所占比例均在10%以上，而J. angkorensis和Coniochaetales sp. GMG C4所占比例均为0;采集自开州不同乡镇的有病症柑橘叶片可能病原物的组成较为相似，主要为uncultured Apatococcus sp.、黄绿异小球藻H. luteoviridis和胶孢炭疽菌C. gloeosporioides这3种，但是这些优势种所占的比例有很大的不同。

3 讨论

本研究应用高通量技术对采自重庆不同区县有青苔病症和无病症的13份柑橘叶样的真核生物物种进行了检测。结果表明，链形植物门Streptophyta、子囊菌门Ascomycota、绿藻门Chlorophyta和担子菌门Basidiomycota是13份样品中真核生物的优势门。通过Alpha多样性分析发现13份样品中真核生物物种的多样性差异不大。说明所选择的采样点虽然生境不同，但柑橘叶际真核生物的种类较为相似。对比分析有病症组和无病症组柑橘叶片生物种类和占比发现两者之间的差异显著，从有病症组中的物种丰度显著高于无病症组的真核生物种类可以推测出可能的病原物为不可培养的球藻uncultured Apatococcus sp.、黄绿异小球藻Heterochlorella luteoviridis、无柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡胶藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、椭圆球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola等。在無病症组中的丰度显著高于有病症组的菌种可能是一些有重要功能的内生菌或附生菌。内共生菌能够通过自身的代谢活动增强寄主植物对病虫害的抗性[19]。

病害的發生流行除病原因素外还需具备适宜的环境条件[20]。通过对比不同区域有病症组可能的病原物组成和占比发现，不同区域间的差异很大，由此可以推测不同区域内引起柑橘青苔病的病原物不尽相同，这可能是不同区域光照、降雨量、相对湿度、温度等气候因子有较大差异造成的。颜学海、Kemp等学者研究表明病原菌多样性与地理区域分布呈现一定相关性[2122]。这与本研究的结果较为一致。

本研究发现柑橘青苔病可能的病原物为不可培养的球藻uncultured Apatococcus sp.、黄绿异小球藻H.luteoviridis、无柄杯梗孢C.sessilis、海南橡胶藻H.hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、椭圆球藻C.ellipsoideum、K.bambusicola、胶孢炭疽菌C.gloeosporioides等。王大平等研究认为柑橘青苔病是由绿藻门虚幻球藻属虚幻球藻Apatococcus lobatus所致[23]，在其后期的研究中又发现该病病原是虚幻球藻和胶孢炭疽菌[24]。而本研究的结果与前人的结论有很大的不同。本研究结果表明柑橘青苔病的病原物大部分属于藻类，其中含量最高的为uncultured Apatococcus sp.，但从高通量测序结果中并未发现虚幻球藻这种球藻。胶孢炭疽菌的相对丰富虽然较高，但与其他病原藻类相比存在的比例仍然较低。此外，胶孢炭疽菌作为柑橘炭疽病的病原菌在柑橘叶际较为普遍，本研究不可排除柑橘既感染柑橘炭疽病又滋生青苔的可能。因此，不能确定胶孢炭疽菌是柑橘青苔病的病原。

为了从柑橘品种相同、品种管理水平相似的果园中采取叶片样本，本试验选择了重庆奉节、开州、忠县3个区县的‘W·默科特柑橘叶片，共采集样品13份。由本次的试验结果可以推测不同品种和不同区域内柑橘叶际生物的种类都会有较大的差异，后续的研究中可以进行相关的探索。此外，健康及患病柑橘叶片间的相互作用有待进一步研究，对于处于不同病情等级下柑橘叶表的生物多样性也值得探索。

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（责任编辑：杨明丽）