张睿泓 侯志广 李广领 李迎东 冯达 李忠华 张鑫宇 逯忠斌

摘要 ：建立了鲜人参样品中多抗霉素B的简易样品前处理程序和HPLC MS/MS检测方法，对0～150 d低温储藏的鲜人参添加样品进行了分析，考察了多抗霉素B在鲜人参样品中的低温储藏稳定性。结果表明，所建立分析方法在0.01～2.0 mg/L范围内线性响应良好，0.2～5.0 mg/kg添加水平的平均回收率为78.0%～94.7%，定量检测限为0.275 mg/kg;鲜人参样品在-18℃和-20℃储藏条件下多抗霉素B的平均降解率均小于30%，说明多抗霉素B在鲜人参样品中至少可以稳定储藏150 d。该结果为多抗霉素B在人参上的残留登记试验提供了可靠的科学依据。

关键词 ：多抗霉素B; 人参; 高效液相色谱质谱; 储藏稳定性

中图分类号：

S 451.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018468

Storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng

ZHANG Ruihong， HOU Zhiguang， LI Guangling， LI Yingdong，

FENG Da， LI Zhonghua， ZHANG Xinyu， LU Zhongbin

（College of Resource and Environment， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China）

Abstract

In order to investigate the low temperature storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng samples， the spiked fresh P.ginseng which were stored at -18℃ and -20℃ for 0-150 days were analyzed by the established simple pretreatment program and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry detection method. The results showed that the established method had a good linear response in the range of 0.01-2.0 mg/L， the average recovery of polyoxins B spiked at 0.2-5.0 mg/kg in blank P.ginseng was between 78.0% and 94.7%， and the limit of quantitative detection was 0.275 mg/kg. The average degradation rate of polyoxins B in fresh P.ginseng samples was less than 30% at -18℃ and -20℃， indicating that polyoxins B can be steadily stored for at least 150 days in fresh P.ginseng samples. This result provides a reliable scientific basis for the polyoxins B residue field trials on P.ginseng field.

Key words

polyoxins B; Panax ginseng; high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; storage stability

在农药登记残留试验中，农药残留试验样品从田间取样后往往会因分析仪器、工作安排或人员调配等原因被储藏一段时间后才被检测。残留农药在样品中的储藏稳定性对农药残留分析工作至关重要，另外它也是农药登记试验数据的重要组成部分[1]。

研究表明，农药在样品中的储藏稳定性主要取决于残留农药自身的理化性质、样品基质特性和储藏温度条件三个方面。Afridi 等[2]在对小麦籽粒中氯菊酯、甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的储藏稳定性的研究中发现，储藏稳定性与残留农药的饱和蒸汽压和水溶性呈明显的负相关关系;Mouvet等[3]比较了水溶性有差异的灭草松、异丙隆、甲草胺和特丁津4种除草剂在水中4℃条件下的储藏稳定性，也发现这4种除草剂的水溶性与储藏稳定性存在负相关关系;Leahey等[4]发现稻谷和小麦样本含水量与其中的甲基立枯磷残留的常温储藏稳定性成反比;Kobayashi等[5]对黄瓜、香梨和马铃薯中乙撑硫脲在-20℃下的储藏稳定性进行了研究，发现乙撑硫脲在pH低的基质里降解速率低于高pH基质;Athanasopoulos等[6]研究了葡萄中甲胺磷常温和0℃下的储藏稳定性，发现0℃下储藏的半衰期为267 d，比常温下高出一个数量级;魏梅等[7]比较了室温、4℃和-20℃3个储藏温度下联苯菊酯和甲氰菊酯在柑橘匀浆物中的储藏稳定性，发现随着储藏温度降低，兩种菊酯类农药在柑橘中的储藏稳定期均表现为增长趋势;董见南[8]研究了10种有机磷杀虫剂和8种杀菌剂残留在甘蓝、番茄和柑橘等7种代表性基质中的储存稳定性，同样发现低温储藏不利于储藏过程中残留农药的降解。残留试验样品的储藏，需要综合考虑待试农药的理化性质及样品基质，并合理地确定储藏条件和储藏时间，这样才能确保储存期间待测物的性质和含量不发生变化，从而确保分析结果的可靠性和科学性。

多抗霉素B（polyoxins B）为生物源抗生素农药，具有高效、安全、低风险的特点，符合当今食品安全、药品安全和生态安全的大方向，其在防治由Alternaria panax Whetz导致的人参黑斑病方面应用潜力巨大。本研究采用模拟添加法，建立并优化鲜人参样品中多抗霉素B残留的高效、高灵敏度的HPLC MS/MS分析方法，研究不同储存温度下鲜人参中多抗霉素B残留的储藏稳定性，为推荐多抗霉素B在人参上登记试验的样品有效储藏期提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 药品、试剂与供试材料

色谱纯甲醇、甲酸、乙腈（购自MREDA公司），分析纯乙酸铵（购自北京鹏彩精细化工有限公司），多抗霉素B标准品（纯度29.0%，购于Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

鲜人参根采自吉林省抚松县有机人参种植基地。

1.2 主要仪器设备

1260系列HPLC（Agilent Technology Inc.，USA），配置真空脱气机、自动进样器、柱温箱和二元泵。6470型三重四极杆质谱仪、SHZ 88型恒温水浴振荡器、IKA T25型高速分散机、YXJ A型高速大容量电动离心机、IKA VORTEX 3型涡旋仪等。

1.3 试验设计

将采集的有机鲜人参样品匀浆液与多抗霉素B标准溶液充分混匀，使多抗霉素B在人参样品中的最终含量分别为1 mg/kg和2 mg/kg。将每5 g混合样品分装于1个50 mL聚丙烯离心管中，分别置于-18℃和-20℃冷冻条件下储存，按0、7、14、28、60、90、120和150 d间隔期取样分析，各次的样品均设3次重复，共计96个样品，另设空白对照和1 mg/kg的质控样品。

1.4 样品前处理

将不同温度下的冷藏样品从冰箱中取出，平衡至室温，加入0.3%甲酸25 mL，涡旋1 min，5 000 r/min离心5 min，移取1 mL上清液，过0.22 μm滤膜至HPLC进样小瓶，待HPLC MS/MS分析。

1.5 色谱和质谱条件

Agilent Zorbax C18分离分析柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），以0.5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸的溶液（A）和乙腈（B）为流动相，梯度洗脱程序为0～1 min内，B由5%增至10%;1～2 min内，B由10%增至20%;2～3 min内，B由20%增至30%;3～4 min内，B由30%增至40%;4～5 min内，B由40%增至60%;5～7 min内，B由60%降至40%;7～9 min内，B由40%降至10%;9～10 min内，B由10%降至5%;平衡5 min。设柱流速0.3 mL/min、柱温恒定30℃、进样5 μL。根据仪器厂商推荐设定质谱各种气体参数、离子源温度、离子喷射电压，其他参数见表1。

1.6 方法性能

分别用10%甲醇将1 000 mg/L质量浓度的多抗霉素B标准溶液稀释成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列浓度的标准溶液;参照1.4描述的样品前处理程序处理空白人参样品，获得空白人参样品提取液，再将不同浓度的多抗霉素B标准溶液溶于相同体积的空白样品提取液制得0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列濃度的基质标准溶液。在1.5仪器条件下进样分析，分别以进样浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，拟合出线性回归方程，评价线性关系，并计算方法的检出限（LOD）及定量限（LOQ）。用基质匹配标准曲线评价基质效应（matrix effects， ME），如果ME≤10%，可忽略样品基质的影响，如果ME>10%，需用基质匹配标准曲线进行定量校准，以减小基质的影响。

采用模拟添加法，用有机鲜人参样品匀浆液进行多抗霉素B的添加回收率试验，添加水平分别为0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg，各添加水平分别做5次重复，分别用计算得到的添加回收率和相对标准偏差表示准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 方法的线性、检出限（LOD）及定量限（LOQ）

图1中a为1 mg/L多抗霉素B标准品的定量离子流色谱图、b为多抗霉素B的两个选择离子的质谱图，c为定性离子色谱图，图2为人参空白样品基质的两个选择离子色谱图（a，c）和质谱图（b）。

由图1和图2可以看出，本研究所用人参样品不含多抗霉素B，且在确定的色谱/质谱条件下，多抗霉素B与人参基质无干扰。

多抗霉素B在纯溶剂中和在空白人参样品基质中的线性回归方程分别为y=3.8x-17.7（R2=0.999 5）和y=1.7x+22.7（R2=0.997 1），说明在确定的仪器条件下，多抗霉素B在0.01～2.0 mg/L质量浓度范围内进样浓度和色谱峰积分面积有良好的线性响应。通过在空白基质提取液中添加少量适当浓度的多抗霉素B标准溶液进样分析，并分别根据3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）计算出的多抗霉素B的LOD为0.413 ng，LOQ为0.275 mg/kg。

2.2 基质效应

基质效应是基质成分复杂的样品HPLC ESI MS/MS分析中较常见的现象，一般认为是由于待测组分与样品基质在ESI过程中雾滴表面离子化的竞争造成的，该结果可能会显著地抑制或增强目标离子的生成效率及离子强度，进而影响到检出限、定量限、线性、准确度和精密度等方法性能指标[9]。文献报道的基质效应补偿措施主要有采用基质匹配标准曲线法、样品稀释法和应用分析物保护剂[10]，其中基质匹配标准曲线法是最常用、最简单，也是有效的方法。根据文献介绍方法[11]计算的多抗霉素B在空白人参样品基质中基质效应值（ME）为56%，说明有明显的基质增强效应，因此，本研究中采用基质匹配标准曲线法对人参样品基质中的多抗霉素B进行定量校准。

2.3 方法的准确度和精密度

鲜人参空白样品中0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg添加水平的回收率和相对标准偏差（RSD）见表2。其中0.2 mg/kg添加水平的平均回收率为94.7%，5次重复的RSD为4.2%;1.0 mg/kg添加水平的平均回收率为74.7%，5次重复的RSD为3.2%;5.0 mg/kg添加水平的平均回收率为78.0%，5次重复的RSD为1.3%。

2.4 储藏稳定性

按照1.3中的试验设计，根据公式（1）计算样品储藏过程中多抗霉素B残留的降解率，当人参在冷冻条件下储存时，人参中的多抗霉素B残留能够保持稳定长达5个月，可以看出，随着样品采集间隔的增长，在鲜人参基质中的残留虽不同程度的减少，但仍然趋于稳定。

D=C0-CtC0×100（1）

式中：D为降解率，单位为百分率（%）;C0为样品的初始浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）;Ct为样品的检测浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）。

由表3可以看出，空白鲜人参中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分别在-18℃和-20℃下储藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大为13.18%;整个储藏过程中，各时间点的样品中多抗霉素B降解率均小于30%，根据植物源性农产品中农药残留储藏稳定性判断标准[12]，空白鲜人参中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分别在-18℃和-20℃下150 d储藏期间内稳定。

由表4可以看出，空白鲜人参中2 mg/kg多抗霉素添加水平分別在-18℃和-20℃下储藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大为14.86%;-18℃和-20℃下，各时间点的样品中多抗霉素降解率均小于30%，根据植物源性农产品中农药残留储藏稳定性判断标准[12]，空白鲜人参中2 mg/kg多抗霉素添加水平分别在-18℃和-20℃下150 d储藏期间内稳定。

3 结论与讨论

农药在生物样品中的低温储藏稳定性是农药登记残留试验的基础资料，而储藏稳定性研究具有周期长的特点，在较长的试验周期内难以保证各项试验条件的稳定性以及每次试验操作的重复性，为了尽可能减小所获取数据的波动，本研究引入质控样品对每次获取的检测数据进行回收率校准，保证了数据的可用性。本文通过建立鲜人参样品中多抗霉素B的简易样品前处理程序和灵敏、可靠的HPLC MS/MS检测方法，对添加多抗霉素B的鲜人参样品经低温储藏，并进行了渐进性测定，结果表明，150 d内各次检测数据均围绕质控上下波动，且在-18℃和-20℃储藏条件下多抗霉素B在鲜人参样品中的降解率均低于30%，说明两个储藏条件下生物农药多抗霉素B在鲜人参样品中150 d储藏期内稳定，该研究为多抗霉素B在人参上的残留登记试验提供了科学依据。

参考文献

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（责任编辑：杨明丽）