李立梅 左彤彤 邹建军 勾天兵 刘庆珍 陈越渠

摘要 ：通過卤虫初筛和花布灯蛾幼虫复筛，从土壤中获得1株具有较高杀虫活性的链霉菌，编号为LKY208，为明确该菌株的生防效果及分类地位，采用叶片浸渍法、饲料染毒法、玻片浸渍法及常规浸虫法分别测定了其对花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫、亚洲玉米螟、二斑叶螨、马铃薯瓢虫、桃蚜8种农林害虫的杀虫活性;并对该菌株发酵液的稳定性进行了初步研究，同时通过形态学和16S rDNA序列分析初步确定了其分类地位。结果表明：该菌株对8种试虫均有致死作用，杀虫谱广，其中对花布灯蛾的致死作用最强，48 h的校正死亡率达72.1%，菌株发酵液对温度耐受性强，在25～50℃杀虫活性稳定;pH 4～7范围内菌株杀虫活性较好，发酵液有较好的光稳定性、贮存稳定性和菌株遗传稳定性，具有较好的开发应用价值;经形态学和16S rDNA序列分析，初步鉴定菌株LKY208为雷格链霉菌Streptomyces regensis，此乃国内外首次报道将链霉菌应用于花布灯蛾的防治。

关键词 ：雷格链霉菌; 分类地位; 生防效果; 花布灯蛾

中图分类号：

S763.306

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019127

Study on the insecticidal activity of a Streptomyces strain

LI Limei1， ZUO Tongtong1， ZOU Jianjun1， GOU Tianbing1， LIU Qingzhen1， CHEN Yuequ1，2

（1. Jilin Provincial Academy of Forestry Science， Changchun 130033， China; 2. Research Institute of

Forest Ecology Environment and Protection， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China）

Abstract

Strain LKY208 with a good insecticidal activity was isolated from soil by using Artemia salina and Camptoloma interiorata. In order to clarify the biocontrol effect and taxonomic status of the strain LKY208， the insecticidal activity of fermented broth of LKY208 against 8 pests was determined by leaf dipping method， feeding with poison， slide dip method and conventional dipping method. Meanwhile， the stability of fermentation broth was also studied. The taxonomic identification was carried out by the morphology and 16S rDNA sequence. The strain LKY208 displayed broad spectrum inhibition activity against all the 8 pests tested， including Camptoloma interiorata， Hyphantria cunea， Plutella xylostella， Ostrinia furnacalis， Pieris rapae， Tetranychus urticae，Henose pilachna vigintioctomaculata and Myzus persicae. The results showed that the insecticidal effect on C.interiorata was the strongest， with a relative mortality of 72.1% after 48 hours. The fermented broth showed a high resistance to temperature and a highly insecticidal activity was still observed at the temperature of 25-50℃. In the range of pH 4-7， its insecticidal activity was good， with a good photochemical stability， storage tolerance and subculture， and thus it deserved further study. On the basis of morphology and 16S rDNA sequence analysis， it was identified as Streptomyces regensis. This is the first report that Streptomyces regensis was applied for the control of C.interiorata.

Key words

Streptomyces regensis; classification; biocontrol effect; Camptoloma interiorata

虫害是制约林业发展一个重要因素，比如美国白蛾Hyphantria cunea，又称美国灯蛾、秋幕蛾，属于世界性检疫害虫，原产于北美洲，具有传播途径广、适应性强、繁殖量大、多食性等特点[1]，对植物的危害性极强，且一旦侵害植物极易暴发成灾，被称为“无烟的火灾”[2]。又如花布灯蛾Camptoloma interiorata，国内主要分布于东北、华北、华东、华中、华南等地区[3]。2010年，花布灯蛾在吉林省輝南县暴发成灾，发生面积3 000 hm2以上[4]。2011年，吉林省花布灯蛾轻度为害林区近1.70万hm2，中度为害林区近1.51万hm2，而2.32万hm2重度受害，发生区域扩大到吉林市、辽源市、通化地区的10个县（市、区）及红石林业局和辉南森经局[5]。花布灯蛾幼虫早春取食树木的芽苞和叶片，导致树木不能正常发芽、抽叶，造成局部枝条干枯、失水，严重影响树木的生长，如果连年为害，甚至可导致幼树死亡。

目前生产上对于害虫的防治仍多采用化学防治，但大量使用化学农药易造成环境污染和破坏生态平衡。杀虫抗生素是一类由微生物产生的具有杀虫活性的次级代谢产物，具有高效、专化和对环境安全等特点。因此，利用拮抗微生物防治花布灯蛾，以菌治虫，最终达到以生物防治为主的综合防治的目的。

放线菌是最早发现有生防作用的一类微生物，国内外相继报道放线菌中的多种链霉菌能够产生杀虫抗生素。阿维菌素是农业生产中应用最为广泛的杀虫抗生素。近几年报道的3 000多种新抗生素中，杀虫抗生素约占5%，如Takahashi等发现的由链霉菌产生的杀虫杀螨抗生素altemicidin[6]，我国学者欧阳谅等发现的梅岭霉素（meilingmycin）[7]，中国医学科学院医药生物技术所和日本北里研究所共同开发的杀虫抗生素戒台霉素（jietacin），但迄今未见关于防治花布灯蛾的抗生素产品的相关报道。

研制开发新型杀虫链霉素对林业可持续发展至关重要，本研究从采自吉林省不同地区的土壤中分离得到217株放线菌，以卤虫Artemia salina初筛和花布灯蛾复筛进行杀虫效果测定，最终获得了1株具有较高杀虫活性的拮抗链霉菌菌株，以期为生物防治提供新的生防因子。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

2016年6月-8月及2017年6月-7月，在吉林省不同地区采集土样30份。详见表1。

1.1.2 供试菌株

链霉菌菌株LKY208，由本实验室从1.1.1中的土壤样品中筛选、分离并保存。

1.1.3 供试虫源

花布灯蛾C.interiorata Walker，鳞翅目灯蛾科，采自大连市金狐山;美国白蛾H.cunea Drury，鳞翅目灯蛾科，采自沈阳苏家屯;小菜蛾Plutella xylostella L.，鳞翅目菜蛾科，采自吉林省林科院伊通基地;亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée，鳞翅目螟蛾科，采自吉林省林科院伊通基地;菜青虫Pieris rapae L.，鳞翅目粉蝶科;采自吉林省林科院伊通基地;二斑叶螨Tetranychus urticae Koch，蜱螨目叶螨科;采自吉林省林科院伊通基地;马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata Motschulsky，鞘翅目瓢甲科;采自吉林省林科院伊通基地;桃蚜Myzus persicae Sulzer，半翅目，蚜科;采自吉林省林科院伊通基地;以上供试虫源为其各自发生期采集及养虫室继代饲养。

1.1.4 供试卤虫

卤虫Artemia salina，又称盐水丰年虫，购自山东省滨州港友发水产有限公司。

1.1.5 供试培养基

高氏一号合成培养基和液体培养基：可溶性淀粉20 g，K2HPO4 0.5 g，KNO3 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。高氏一号液体培养基除不含琼脂外，其他成分同合成培养基。

发酵培养基：花生饼粉2.5%、可溶性淀粉50%、酵母粉0.08%、葡萄糖0.02%、（NH4）2SO40.08%、NaCl 0.2%、CaCO30.32%，pH 7.0～7.2。

人工海水参考熊丽霞[8]配方：NaCl 24.48 g，MgCl2·6H2O 4.98 g，Na2SO4 3.92 g，CaCl2·H2O 2.23 g，NaHCO3 0.19 g，KCl 0.66 g，NaBO3 0.03 g，SrCl20.02 g，NaF 0.01 g，1000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤样品采集

选择好适当地点后，用小铲除掉表层土，取5～10 cm深处的土壤约30～50 g，装入灭菌的纸袋中，编号，并注明采集地点和采集日期等信息，用于链霉菌的分离。

1.2.2 链霉菌的分离与纯化

采用平板稀释分离法分离和纯化链霉菌[9]。为减少杂菌、尤其是细菌的污染，先将称好的10 g土壤120℃烘烤1 h，然后加入100 mL无菌水中，振荡30 min后，吸取1 mL混悬液，用无菌水梯度稀释，依次从10-3、10-4和10-5稀释管内分别吸取0.1 mL混悬液滴到高氏一号平板上，均匀涂布，然后将培养皿倒置于28℃恒温箱内培养3～10 d，每天观察并挑选菌落形态各不相同的菌株及时转接到高氏一号斜面上培养，采用稀释分离法重新纯化3～5次后，编号并保存至4℃冰箱中备用。

1.2.3 摇瓶发酵初筛杀虫活性菌株

发酵液的制备：将1.2.2中分离纯化的链霉菌转接至高氏一号平板培养基上，28℃下培养7 d后，使用7 mm打孔器打菌饼接种至装有40 mL发酵培养基的250 mL三角瓶内（每瓶15个菌饼），28℃，150 r/min，振荡培养5 d，发酵液以6 000 r/min，离心20 min，取上清液过细菌滤器去除菌体备用。

杀虫活性的测定：采用卤虫初筛[10]。测定时，将卤虫卵置于人工海水中，28℃活化24 h。在96孔细胞培养板中分别加入0.1 mL卤虫液（约20～30头卤虫）和0.1 mL待测菌株的发酵液，以高氏一号液体培养基为对照，28℃培养24 h后，双目解剖镜观察并统计卤虫死亡率和校正死亡率。

死亡率=死亡虫数供试虫数×100%;

校正死亡率=处理死亡率-对照死亡率1-对照死亡率×100%。

1.2.4 摇瓶发酵复筛杀虫活性菌株

杀虫活性测定：以花布灯蛾幼虫为试虫。采用叶片浸渍法[11]，取新鲜蒙古栎叶片用菌株发酵液浸湿，置于灭菌的培养皿中，晾干后接入2～3龄花布灯蛾幼虫，每皿20头，3次重复，另设浸渍高氏一号液体培养基为空白对照，阿维菌素1 000倍液为阳性对照，分别置于人工气候培养箱（25℃±1℃，RH70%～80%，光周期L∥D=16 h∥8 h）中饲养，48 h后统计试虫生存情况，计算死亡率和校正死亡率。

1.2.5 链霉菌LKY208发酵液杀虫谱的测定

LKY208为1.2.4小节筛选获得的活性最高的菌株。花布灯蛾、美国白蛾、小菜蛾、菜青虫、桃蚜的杀虫活性测定采用叶片浸渍法（方法同1.2.4）。

玉米螟的杀虫活性测定采用饲料染毒法[12]。均匀切取一定大小的饲料（约为幼虫的一日食量），将菌株发酵液拌入高压灭菌后的人工饲料中（100 μL/g），饲喂2龄玉米螟幼虫。每处理20头幼虫，重复3次。以人工饲料拌高氏一号液体培养基为对照。48 h后在双目解剖镜下统计试虫生存情况，计算死亡率和校正死亡率。

二斑叶螨的杀虫活性测定采用玻片浸渍法[13]。粘贴时注意不要粘住螨的足和口器，确保其肢体可以活动。每玻片粘25头，3次重复。将粘有二斑叶螨的载玻片置于人工气候培养箱中（条件同上）饲养4 h后，用双目镜观察并剔除死亡或不活泼个体，然后把粘有二斑叶螨的载玻片一端浸入发酵液中，用滤纸吸干螨体及周围多余的液体，重新置于人工气候培养箱中饲养。另以粘螨玻片浸渍高氏一号液体培养基为对照。48 h后，在双目解剖镜下统计试虫生存情况，计算死亡率和校正死亡率。

马铃薯瓢虫的杀虫活性测定采用常规浸虫法[14]。将供试昆虫放入浸虫器中，于菌株发酵液中浸30 s，取出后放入养虫瓶中，培养方法同上。每处理成虫20头，重复3次，以试虫浸渍高氏一号液体培养基为对照，饲养条件同上。48 h后在双目解剖镜下检查试虫生存情况，计算死亡率和校正死亡率。

1.2.6 发酵液热稳定性测定

取等量菌株发酵液分别于30、40、50、60、70、80、90℃和100℃下处理1 h后取出，自然冷却后，对2～3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液（25℃）為对照。

1.2.7 发酵液pH稳定性测定

取等量菌株发酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分别调整pH为1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13和14，静置24 h后调回pH 7，对2～3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液为对照。

1.2.8 发酵液光照稳定性测定

取等量菌株发酵液分别置于日光下照射1、2、3、4、5 h后，对2～3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液为对照。

1.2.9 发酵液耐贮性测定

取等量菌株发酵液分别在4℃、50℃、-20℃的恒温条件下贮存15 d后，将发酵液恢复至原体积，对2～3龄花布灯蛾幼虫进行杀虫活性检测，以未处理的发酵液（25℃）为对照。

1.2.10 菌株遗传稳定性测定

将链霉菌LKY208转接至高氏一号斜面培养基上，记为F1代，28℃条件下培养5～6 d后，再转接斜面，记为F2代，依次继代转接直至F6代。取上述分别培养7 d的F1、F2、F3、F4、F5、F6代斜面培养体，按上述的发酵方法进行发酵，检测各代菌株发酵液对2～3龄花布灯蛾幼虫的杀虫活性。

1.2.11 菌株鉴定

将菌种接种至高氏1号琼脂平板上，将灭菌盖玻片以45o斜插在培养基中，28℃培养5～7 d后，取出盖玻片，在光学显微镜下直接观察;同时，选择菌丝生长疏密适中，但气生菌丝和孢子丝发育良好的部分，真空喷镀制片后，用扫描电镜观察孢子链和孢子形态及表面结构，处理方法参考杨瑞等[15]的方法。

参照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，上下游引物（F：5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′/R：5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′）由宝生物（大连）工程有限公司合成。50 μL PCR反应体系：PCR Mixture 25 μL、模板2 μL、上下引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR反应条件：94℃变性5 min;94℃变性1 min，56℃复性1 min，72℃延伸2 min，35次循环;72℃延伸5 min，4℃保存，以无菌水的PCR产物为阴性对照，以已知16S rDNA的菌株PCR产物为阳性对照。按上样量2 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳。回收产物送至宝生物（大连）工程有限公司进行双向测序，序列经BioEdit 7.0.1等软件分析和手工校正后，用NCBI的BLAST程序将测出的序列与在GenBank中下载的已知相似模式菌种的序列进行同源性比较分析，并用 MEGA 6.0软件的邻接法（neighbor joining，NJ）进行序列比对并绘制系统发育树图。

1.3 数据统计

采用 SPSS 17.0进行数据统计，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 链霉菌的分离与纯化

从采集的30份土壤样品中共分离得到217株链霉菌菌株，将上述菌株在高氏一号斜面培养基中培养，4℃保存，作为原始菌株备用。

2.2 摇瓶发酵初筛结果

将分离得到的217株链霉菌菌株进行摇瓶发酵。以卤虫为靶标进行杀虫活性测定，获得12株对卤虫致死率达50%以上的菌株，其中编号LKY208号菌株效果最好，校正死亡率达94.2%，LKY23杀虫活性次之，校正死亡率可达90%（表2）。

2.3 摇瓶发酵复筛结果

将初筛获得的5株对卤虫具有较高活性的链霉菌菌株进行摇瓶发酵培养，以花布灯蛾幼虫为靶标进行杀虫活性测定，48 h后观察统计，结果见表3。菌株LKY208对花布灯蛾幼虫的杀虫活性最高，校正死亡率达73.5%，与其他供试菌株差异显著，与供试的生物药剂阿维菌素差异不显著，菌株LKY23对花布灯蛾幼虫亦有较好的杀虫活性，校正死亡率为65.0%，与阿维菌素差异显著。

1） 表中数据为平均值±标准差。

Data in the table are mean±SD.

1） 表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差方法检验在P<0.05水平差异显著。下同。

Data in the table are mean±SD. Lowercase letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 by Duncans new multiple range test. The same below.

2.4 链霉菌LKY208发酵液杀虫活性的测定

分别测定了菌株LKY208发酵液对8种农林害虫的杀虫活性，研究结果表明（表4），菌株LKY208发酵液对鳞翅目花布灯蛾幼虫的杀虫活性最高，48 h的校正死亡率可达72.1%，对鳞翅目小菜蛾幼虫和美国白蛾幼虫的杀虫活性仅次于花布灯蛾幼虫，校正死亡率分别为69.5%和66.6%，与其他试虫差异显著，同时对鳞翅目菜青虫和玉米螟48 h的校正死亡率分别为36.9%和32.8%;对二斑叶螨亦具有较好的杀虫活性，48 h的校正死亡率达44.8%;但对半翅目害虫桃蚜和鞘翅目害虫马铃薯瓢虫致死作用不明显。

2.5 链霉菌LKY208发酵液稳定性测定

2.5.1 热稳定性测定

经不同温度处理后，菌株LKY208发酵液的杀虫活性略有变化。温度低于50℃时，发酵液对花布灯蛾幼虫的杀虫活性较好，保持了很好的稳定性，但当温度高于50℃时，杀虫效果有所下降（图1），但即使温度达到100℃，LKY208发酵液仍然具有杀虫活性。

2.5.2 pH稳定性测定

分别测定pH 1～14处理后菌株LKY208的发酵液活性的变化。当pH 7时发酵液的杀虫活性最高，在pH小于7时，发酵液杀虫活性略有降低，但当pH超过9时，菌株发酵液的杀虫活性明显降低（图2），因此菌株发酵液在偏酸和中性条件下活性稳定，且活性明显高于经碱性条件处理的发酵液。

2.5.3 光照稳定性测定

菌株LKY208的发酵液经不同光照时间处理后，其对花布灯蛾的杀虫活性变化较小（图3），说明菌株LKY208发酵液中的杀虫活性物质对光照稳定，不易分解。

2.5.4 耐贮性测定

菌株LKY208的发酵液在50℃、4℃、-20℃保存15 d后，对花布灯蛾的杀虫活性与对照相比活性变化不大。发酵液具有可贮藏性，可以长期保存，以4℃低温贮藏效果最好（图4）。

2.5.5 遗传稳定性测定

试验结果表明（图5），链霉菌LKY208继代培养后发酵液对花布灯蛾的杀虫活性与原始菌株相比，表现了极强的遗传稳定性。

2.6 菌株鉴定

2.6.1 菌株LKY208形态学鉴定

菌株LKY208在高氏一号培养基上生长茂盛，气生菌丝丰茂，28℃培养1～2 d时，菌落光滑、无孢子生成，第3天开始可见气生菌丝呈黄绿色、淡黄绿色、淡黄色，4 d后基质颜色逐渐变为黄色，7 d时气生菌丝逐渐变成褐绿色。在显微镜下观察，基内菌丝无横膜，不断裂;电镜观察结果表明孢子丝短，偶见短而松散螺旋状（图6a），孢子椭圆形、柱形，表面光滑或不规则褶皱（6b），根据形态特征初步分析菌株LKY208为链霉菌属。

2.6.2 菌株LKY208的16S rRNA鉴定

对菌株LKY208的16S rRNA基因序列进行PCR扩增、纯化、测序后，测得其序列长度为1 388 bp。与GenBank数据库的16S rDNA序列相比，与雷格链霉菌Streptomyces regensis的同源性最高，相似值均在 99% 以上。选择与菌株LKY208同源性较高的10个菌株，建立系统发育树，结果表明，菌株LKY208与Streptomyces regensis strain NBRC（GenBank：NR 112402.1）等4个菌株，聚在一个分支，亲缘关系最近，因此初步鉴定菌株LKY208为雷格链霉菌（MH 473142）（图7）。

3 结论与讨论

随着害虫生物防治研究的不断发展，微生物源农药的研制已成为国内外研究的热点之一。放线菌在自然界中分布广泛，代谢产物种类丰富，是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，而链霉菌属又是放线菌中產生抗生素最多的一个属。因此，从链霉菌中筛出的可产生高效杀虫活性物质的菌株具有非常好的开发应用前景。

传统杀虫抗生素的筛选都是以目标昆虫为靶标，耗费人力及物力。利用小型活体动物进行早期初筛，继而用目标昆虫进行复筛是目前被广泛认可的筛选策略[16]。因此本研究选定卤虫为初筛研究对象，减少前期的工作，节约了时间和成本。

本试验利用稀释分离法从采集到的各类土壤样品中共分离到217株链霉菌，以卤虫为初筛指示生物，获得12株对卤虫致死率达50%以上的链霉菌菌株，其中LKY208的杀虫活性，高达94.2%;以花布灯蛾为靶标，以初筛较好的5株拮抗菌株为试材进行复筛，结果发现编号为LKY208的菌株对花布灯蛾的杀虫效果明显，48 h的校正死亡率可达735%，具有很好的研究和开发前景。

利用室内生物测定方法测定了链霉菌LKY208菌株发酵液对多种昆虫的杀虫效果。结果表明：菌株LKY208发酵液对花布灯蛾的杀虫活性最高，48 h的校正死亡率可达72.1%，对鳞翅目小菜蛾幼虫和美国白蛾幼虫的杀虫活性仅次于花布灯蛾幼虫，校正死亡率分别为69.5%和66.6%，对二斑叶螨也具有较好的杀虫活性，48 h的校正死亡率达44.8%;但对桃蚜和马铃薯瓢虫的杀虫作用不明显，这可能是因为微生物的次生代谢产物对昆虫的毒杀作用具有较高的选择性，一般一类次生代谢产物可能仅对某些种类的昆虫有作用。

对菌株LKY208发酵液进行的稳定性试验结果表明：发酵液在50℃以下、pH为偏酸性和中性条件下杀虫活性比较稳定;具有良好的光照稳定性、耐贮藏性;且菌株遗传性稳定。因此，菌株LKY208具有很好的开发研究价值及应用前景。

利用16S rRNA基因对菌株LKY208进行了分类鉴定，将菌株LKY208初步定名为链霉菌属雷格链霉菌Streptomyces regensis。

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（责任编辑：杨明丽）