刘梦姚 王娟 王曼姿 高飞 张洪志 李玉艳 臧连生 张礼生

摘要 ：保幼激素（juvenile hormone， JH）可以調控昆虫滞育，保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase， JHEH）是调节保幼激素代谢的关键酶之一。为探索JHEH在七星瓢虫Coccinella septempunctata L.滞育中的调控作用，利用RT PCR和RACE技术克隆获得七星瓢虫JHEH全长基因，命名为Csjheh （GenBank登录号：MH932586）， 该基因cDNA全长2 077 bp，开放阅读框（ORF）1 380 bp，编码459个氨基酸，预测蛋白质分子量为51.39 kD，理论等电点（pI）为8.79。疏水性分析结果显示该基因具有典型环氧水解酶的N末端疏水结构。氨基酸序列比对结果表明，Csjheh与中欧山松大小蠹、赤拟谷盗、丽蝇蛹集金小蜂、内华达古白蚁保幼激素环氧水解酶同源性达到64.24%。利用实时荧光定量 PCR 技术研究其时空表达模式，结果表明Csjheh基因在七星瓢虫成虫初羽化阶段表达量较高，滞育诱导条件下表达量呈先下降后上升的趋势，滞育60 d时与初羽化阶段接近。本研究结果对揭示JHEH参与JH的调控作用，进而调控昆虫滞育提供了理论参考。

关键词 ：七星瓢虫; 保幼激素环氧水解酶; 基因克隆; 时空表达

中图分类号：

S 476.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018496

Cloning and expression analysis of juvenile hormone epoxide hydrolase

in Coccinella septempunctata

LIU Mengyao1，2， WANG Juan2， WANG Manzi1，2， GAO Fei2， ZHANG Hongzhi2，

LI Yuyan2， ZANG Liansheng1， ZHANG Lisheng2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Key Laboratory of Integrated Pest

Management in Crops， Ministry of Agriculture and Rural Areas， Sino American Biological Control Laboratory，

Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Juvenile hormone epoxide hydrolase （JHEH） is one of the most important enzymes in regulating juvenile hormone （JH） metabolism， which is of great significance in insect diapause regulation. In order to explore the regulation of JHEH in diapause of Coccinella septempunctata L.， the full length cDNA of the gene encoding JHEH in C.septempunctata （Csjheh） was cloned by using RT PCR and RACE. The full length sequence was 2 077 bp， which consisted of a 1 380 bp open reading frame （ORF） encoding 459 amino acid residues with a molecular mass of 51.39 kD and a theoretical isoelectric point of 8.79. The results of amino acid sequence alignment showed that Csjheh was homologous to those of Dendroctonus ponderosae， Tribolium castaneum， Nasonia vitripennis and Zootermopsis nevadensis， with an amino acid identity of 64.24%. The expression profile of Csjheh was detected by using real time fluorescent quantitative PCR at different stages of diapause. The results showed that the expression level of Csjheh gene was the highest in the initial emergence stage of the adult ladybug， and then it decreased firstly but increased in the later time of diapause， at which stage the expression level was close to that at the initial emergence stage. The results of this study have important implications for revealing the role of JHEH in the regulation of JH， which plays an important role in the regulation of diapause.

Key words

Coccinella septempunctata; juvenile hormone epoxide hydrolase; gene cloning; expression

七星瓢虫Coccinella septempunctata L.是一种优良的捕食性天敌昆虫，产卵量大，定殖性强，存活时间长，寄主范围广，成虫和幼虫均能持续控制蔬菜、果树、作物上的蚜虫、粉虱、蓟马、介壳虫等害虫为害[12]，在国内外已被广泛应用，并实现其大规模商品化扩繁[3]。该虫属于完全变态昆虫，经过卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段，以成虫进行滞育越冬或越夏[46]。掌握其滞育调控技术，可以延长其产品货架期，促进天敌昆虫产业发展，具有重要的生产实践意义。

保幼激素（juvenile hormone， JH）是一种倍半萜烯类亲脂性激素，参与昆虫的滞育调控[7]。该激素由咽侧体合成并释放到血淋巴，通过保幼激素的合成和降解代谢共同维持其滴度平衡[89]。大量研究证明昆虫滞育期间保幼激素滴度维持在很低的水平，解除滞育后又恢复正常水平。在滞育诱导期滴加外源保幼激素会延缓昆虫进入滞育的时间，已经进入滞育的昆虫滴加外源保幼激素会暂时解除滞育[1012]。滞育的蓼蓝齿胫叶甲Gastrophysa atrocyanea雄虫被点滴保幼激素后，

滞育解除，性腺发育和交配行为恢复[13];给处于滞育的黄钩蛱蝶Polygonia c aureum滴加外源保幼激素类似物甲氧普林可打破滞育[14]。保幼激素的代谢由保幼激素环氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase， JHEH）、保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase，JHE）和保幼激素二醇激酶（juvenile hormone diol kinase， JHDK）等共同催化完成，其中JHEH降解JH和保幼激素酸（juvenile hormone acid，JHa），降解产物分别为保幼激素二醇（juvenile hormone diol， JHD）和保幼激素酸二醇（juvenile hormone acid diol， JHAD）[15]。截至目前，针对保幼激素降解代谢的研究主要集中于保幼激素酯酶的作用机制[16]，研究显示JHEH对保幼激素参与的代谢调控通路也起到重要作用[17]。本研究以七星瓢虫为研究对象，利用RACE技术对保幼激素环氧水解酶JHEH进行全长基因克隆，对该基因序列进行生物信息学分析，运用实时荧光定量PCR技术研究了该基因在七星瓢虫滞育各阶段的转录水平，为进一步探究JHEH调控JH的作用机制进而调控滞育提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试七星瓢虫为中国农业科学院植物保护研究所天敌昆虫组饲养种群，饲养方法参见王伟等[6]。饲养条件为：温度（24±1）℃、相对湿度70%±10%、光周期L∥D=16 h∥8 h，饲养至产卵，为正常发育组。将正常发育下初羽化的成虫雌、雄配对，转移至滞育诱导条件下饲养，诱导条件为温度（18±1）℃、光周期L∥D=10 h∥14 h，相对湿度70%±10%，饲养40 d未产卵为滞育组，判断方法参考王伟等[6， 18]。将滞育组转移至正常条件饲养，第一次产卵后为滞育解除组。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂RNAiso Plus、RACE试剂盒SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech、反转录试剂盒及荧光定量试剂盒均购自TaKaRa公司。cDNA第一链合成、PCR扩增试剂盒购于北京擎科新业生物技术有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 RNA提取与cDNA第一链合成

取滞育雌虫于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末，转入1.5 mL RNase free离心管中，根据RNAiso Plus试剂盒说明书提取总RNA。在微量分光光度计（NanoPhotometer P class， Implen）上检测RNA浓度和纯度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照反转录试剂盒操作说明合成cDNA模板，3′和5′第一链cDNA按照RACE试剂盒说明书合成，置于-80℃冰箱保存。

1.4 jheh 基因克隆及序列分析

1.4.1 引物设计与合成

基于本实验室前期测得转录组数据，鉴定得到jheh基因序列，利用Primer Primer 5.0软件设计一对RACE特异性引物及荧光定量引物（表1）。所有引物均由北京擎科新业生物技术公司合成。

1.4.2 中间片段扩增

以滞育七星瓢虫cDNA为模板，利用jheh f1、jheh r1，jheh f2、jheh r2两对引物进行PCR中间序列扩增。反应体系（50 μL）： PCR Mix 45 μL，引物各2 μL，cDNA 1 μL，轻微振荡混匀，瞬时离心，进行PCR反应。反应程序：98℃变性2 min;98℃ 10 s， 56℃ 10 s， 72℃ 15 s，30个循环;72℃，5 min;产物置于4℃保存。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带进行回收纯化。将回收产物与克隆载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素筛选后挑选阳性克隆子进行扩大培养送至北京擎科生物公司测序。

1.4.3 3′和5′RACE PCR

以3′和5′第一链cDNA为模板，按照SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech試剂盒说明书进行RACE全长扩增。反应体系（50 μL）：15.5 μL PCR Grade H2O， 25.0 μL 2×SeqAmp Buffer，1.0 μL SeqAmp DNA Polymerase，混匀后加入2.5 μL模板，5.0 μL 10×UPM，1.0 μL jheh 5′/jheh 3′。反应程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环;94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25个循环。将3′/5′RACE PCR产物回收，连接，转化，测序。

1.4.4 序列拼接与信息分析

将所得序列利用DNAMAN和EditSeq进行DNA序列分析并拼接获得七星瓢虫jheh基因cDNA全长序列。利用ORF Finder （https：∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找完整的開放阅读框并预测氨基酸序列。利用NCBI BLAST软件进行序列比对以及同源序列搜索，MEGA 6.0进行系统进化树构建。利用PredictProtein （https：∥www.predictprotein.org/）在线分析和ExPASy Proteomics Server在线软件ProtParam tool（http：∥www.expasy.ch/tools/protparam.html）、Prot Scale在线软件（http：∥expasy.org/tools/protscale.html）、SignalP 4.0 Server在线分析（http：∥www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）、TMHMM Server v.2.0（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结构的预测等预测蛋白的二级和三级结构、保守结构域、亲疏水区等。

1.5 jheh基因时间表达分析

应用染料法在ABI 7500实时荧光定量仪上测定Csjheh基因表达量。收集不同发育时期（初羽化、滞育10 d、滞育20 d、滞育30 d、滞育60 d、正常发育组、滞育解除组）的七星瓢虫雌虫，取样，提取总RNA。根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行jheh基因时间表达分析。反应体系 （20 μL）：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （Tli RNaseH Plus） （2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ （50×） 0.4 μL，cDNA 2 μL，超纯水6 μL。振荡混匀，离心，进行RT qPCR反应。反应条件：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环;熔解曲线条件：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。试验采用3个生物学重复，4个技术重复。基因的相对表达量计算采用2-△△Ct法。

2 结果与分析

2.1 七星瓢虫保幼激素环氧水解酶基因克隆与序列分析

基于七星瓢虫转录组数据，以滞育七星瓢虫cDNA作为模板，克隆得到七星瓢虫jheh基因，命名为Csjheh （GenBank登录号： MH932586）。序列分析表明，Csjheh基因cDNA全长2 077 bp，开放阅读框（ORF）1 380 bp，编码459个氨基酸，5′非编码区105 bp，3′非编码区592 bp（图1）。预测蛋白的分子量为51.39 kD， 理论等电点为8.79，存在一个跨膜结构，位于第7-29个氨基酸之间（图2），属于跨膜蛋白。在该蛋白的第53-163个氨基酸之间存在EHN环氧水解酶超家族结构域，具备环氧水解酶的典型结构特征。以保幼激素环氧水解酶（SMTL ID： 4qla.1.A）为模型预测Csjheh的3D结构为同源JHEH序列，序列相似度约为49.65%（图3）。

2.2 Csjheh基因的同源性分析及系统进化树的构建

将Csjheh基因的氨基酸序列在NCBI中BLAST搜索比对发现，Csjheh基因在不同物种中的同源性较高。从中选取4种不同昆虫的JHEH氨基酸序列进行同源性分析，结果显示相似性达到64.24%，保守性较高（图4）。从NCBI数据库选取20种同源性较高的不同物种，利用MEGA 4.0软件，通过neighbor joining（N J）方法构建JHEH氨基酸序列进化树。从进化树中可以看出，Csjheh蛋白序列与鞘翅目、膜翅目等亲缘性具有较高一致性，其中与中欧山松大小蠹Dendroctonus ponderosae （登录号XP-019766997.1）亲缘关系最近，聚为一支，其余以目为类群，同目物种亲缘关系较近，同源性较高（图5）。

2.3 Csjheh基因的时空表达分析

采用实时荧光定量PCR的方法，以18S rRNA和actin为双内参，根据2-△△Ct法对Csjheh基因在滞育不同阶段的表达量进行检测。结果如图6所示，Csjheh基因在七星瓢虫滞育各阶段均有表达，初羽化时期表达量较高，滞育10 d时显著降低，随着滞育时间增加，表达量逐渐增加，滞育60 d时表达量达最高。正常发育和滞育解除后表达量没有显著差异。

3 讨论

保幼激素在昆虫生长发育中具有重要作用，保幼激素环氧水解酶是保幼激素的分解酶之一，是调控昆虫体内保幼激素滴度的重要酶。保幼激素环氧水解酶基因首先在烟草天蛾中被克隆出来[1920]，迄今为止，已经在家蚕Bombyx mori、意大利蜜蜂Apis mellifera、赤拟谷盗Tribolium castaneum、黑腹果蝇Drosophila melanogaster等多种昆虫中进行了研究报道，证明保幼激素环氧水解酶的典型结构特征是在N末端具有疏水信号肽结构[2124]。保守区域与其他昆虫一样具有真核生物环氧水解酶的典型结构特征，对近源物种进行同源比较，构建进化树分析表明，七星瓢虫保幼激素环氧水解酶Csjheh与同属鞘翅目的中欧山松大小蠹保幼激素环氧水解酶亲缘关系最近。

滞育是昆虫适应不良环境的一种生存策略，保幼激素可以调控昆虫的滞育[25]。作为保幼激素的关键分解酶，保幼激素环氧水解酶在调节保幼激素滴度方面起到重要作用[26]。前人研究证明保幼激素具有保持幼虫形态与促进成虫生殖系统发育的作用，滞育阶段保幼激素滴度极低，抑制生殖系统发育是导致成虫生殖滞育的重要原因[2728]。本研究通过实时荧光定量PCR检测发现Csjheh基因在七星瓢虫滞育的各个阶段均存在特异性表达。其中初羽化成虫体内表达量较高，滞育条件下降低，随着滞育诱导时间的增加，表达量又逐渐增加，在滞育60 d时达到与初羽化接近的程度。初羽化成虫体内具有大量的保幼激素环氧水解酶Csjheh，调控保幼激素滴度降低至正常浓度。在滞育诱导条件下，Csjheh表达量逐渐增加，调控保幼激素滴度降低至极低浓度，七星瓢虫成虫进入滞育状态。推测保幼激素环氧水解酶Csjheh在七星瓢虫滞育过程中通过调节保幼激素滴度从而参与调控其滞育过程。

本研究通过克隆得到保幼激素环氧水解酶cDNA全长，分析序列特征，并从mRNA水平检测了该基因在七星瓢虫雌虫体内滞育不同阶段的时间表达模式。该研究为进一步利用RNA干扰技术研究该基因的功能奠定了基础，为更好的应用七星瓢虫防治害虫提供了理论依据。

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（责任编辑：田 喆）