仇新媛 姚忠 耿志明 马晶晶 李鹏鹏

摘 要：通过优化抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数及二抗稀释倍数等参数，建立白条鸭表皮组织中脱氢松香酸（dehydroabietic acid，DHAA）含量的间接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法。白条鸭表皮组织中的DHAA用甲醇提取，经磷酸盐缓冲液稀释，使用酶标板进行检测。结果表明：最佳抗原包被质量浓度为1.0 ?g/mL，最佳抗体稀释倍数为1∶6 400，最佳二抗稀释倍数为1∶10 000;ELISA方法的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g;在100～5 000 ng/g添加量范围内，DHAA回收率为78.2%～97.2%;实际样品分析结果显示，市场流通领域中白条鸭表皮组织中DHAA的检出率达到87%，含量范围为118.6～1 199.2 ng/g。

关键词：白条鸭表皮组织;松香;脱氢松香酸;残留;酶联免疫吸附测定

Abstract： An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was developed for determination of dehydroabietic acid （DHAA） in duck skin. DHAA in duck skin samples was extracted with methanol， followed by dilution with phosphate buffer saline （PBS）， and determined by an ELISA reader. Results indicated that the optimal coating antigen concentration and the optimal dilution of antiserum were found to be 1.0 ?g/mL and 1：6 400， respectively， while the optimal dilution of HRP-IgG antibody was 1：10 000， the limit of detection and the working concentration range were 41.0 ng/g and from 100.0 to 20 150.0 ng/g respectively. The recoveries from spiked samples at concentration levels of 100–5 000 ng/g were in the range of 78.2%–97.2%. When the method was applied to real samples， DHAA was detectable in up to 87% of the samples at levels of 118.6–1 199.2 ng/g.

Keywords： duck skin; rosin; dehydroabietic acid; residue; enzyme-linked immunosorbent assay

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190909-214

中图分类号：TS207.3                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）12-0045-05

松香是来源于松树的一种天然物质，包含多种树脂酸，其中松香酸（abietic acid，AA）和脱氢松香酸（dehydroabietic acid，DHAA）是其主要成分。AA和DHAA能显著抑制水蚤、虹鳟鱼等的生长发育[1]。在细胞毒理学方面，AA可导致人体肺泡上皮细胞溶解，而DHAA能够促进人体上皮细胞、成纤维细胞死亡并对人体红细胞有毒害作用[2]。作为一种普通工业原料，松香被广泛用于肥皂、造纸、油漆涂料等领域。AA和DHAA广泛存在于造纸厂废水中，在日用消费品，如药剂、化妆品等中也常有检出，甚至可以通过包装材料迁移进入食品中[3-4]。

因加热后具有优良的黏附特性，松香曾被畜禽屠宰加工企业广泛用于畜禽屠宰，尤其是鸭（鹅）屠宰的二次脱毛。值得关注的是，残留在水禽胴体中的AA和DHAA经过烹饪加工后依然残留在水禽肉制品中，给消费者健康带来潜在危害[5]。2009年，我国《食品安全法》禁止在畜禽屠宰中使用松香脱毛，但是中小畜禽加工企业违禁使用松香脱毛的现象仍然十分严重。

AA和DHAA作为松香残留的主要标志物，一般通过气相色谱（gas chromatographic，GC）法和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行分析[6-8]。相对而言，HPLC的应用更为普遍[9-11]。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法灵敏度高，具有特异性强、成本低、检测容量大等特点，适用于大批量样本中微量污染物的快速分析[12-14]。近年来，ELISA技术发展迅速，除醫药、临床领域外，在环境监测、食品安全等方面也获得广泛应用，并已成为有机污染物残留快速检测的主要分析手段之一[15-17]。本课题前期建立了水禽肉制品中AA和DHAA同时测定的HPLC-紫外-荧光分析方法，同时成功合成了DHAA的人工抗原，并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体[18-20]。因此，本研究通过优化抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数及二抗稀释倍数等参数，进一步建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA检测方法，为畜禽产品中松香残留快速分析方法标准的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

23 种品牌冷冻白条鸭 南京冷链批发市场。

AA标准品（纯度95%） 北京百灵威科技有限公司;DHAA标准品（纯度98%）、异海松酸标准品（纯度98%）、长叶松酸标准品（纯度97%）、海松酸标准品（纯度95%） 北京乐博生物科技有限公司;辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G）（IgG-HRP） 上海拜力生物科技有限公司;其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Epoch2全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;Biofuge stratos高速离心机 德国Heraeus公司;T25高速匀浆机 德国IKA公司;酶标板 上海源叶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DHAA人工抗原合成及抗体制备

前期研究中合成了DHAA的人工抗原并制备了多克隆抗体[21]。简述如下：以脱氢松香胺（dehydroabietylamine，DHAM）作为半抗原，首先与琥珀酸酐（succine anhydride，SUC）进行酰化反应，生成DHAM-SUC，通过红外光谱、核磁共振及质谱进行表征;DHAM-SUC进一步分别与牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）进行偶联反应，合成完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH，偶联比分别为12∶1和35∶1;用DHAM-SUC-KLH免疫家兔，制备、纯化抗血清;以DHAM-SUC-BSA为包被抗原，采用间接ELISA测定抗血清滴度。结果表明，4号新西兰大白兔的抗血清效价达1.28×105，可以用于建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA方法。

1.3.2 标准溶液的配制

称取适量的DHAA标准品，用甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液;用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）稀释成质量浓度分别为10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560、5 120 ng/mL的系列工作溶液。

1.3.3 间接竞争ELISA测定步骤

参考Gurmit等[22]的方法。以一定质量浓度的抗原包被96 孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜;12 h后倾去孔内液体，用磷酸盐-吐温缓冲液（phosphate buffer saline with Tween-20，PBST）洗涤3 次，每次5 min，在干净的吸水纸上拍干;用质量浓度2 g/100 mL明胶（纯水配制）进行封闭，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3 次后拍干;加入系列质量浓度的标准溶液（或被检抗原）和一定稀释倍数的抗血清，按体积比1∶1混合后，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗涤3 次后拍干;加入一定稀释倍数的羊抗兔IgG-HRP，每孔100 μL，37 ℃孵育5 min，PBST洗涤3 次后拍干;加入新鲜配制的四甲基联苯胺底物溶液，每孔100 μL，显色10 min;每孔加入50 μL 2 mol/L浓硫酸终止反应;反应结束后，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔光密度（optical density，OD） 值。以标准溶液质量浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制率曲线。抑制率按下式计算。

1.3.4 样品前处理

参考张苏珍等[23]的方法，并稍作修改。分别在每只肉鸭颈、翅、胸、背、腿5 个部位取表皮组织，剪碎、混合均匀备用。称取2 g混合样品置于10 mL离心管，加入4 mL甲醇，超声振荡15 min后4 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液加入1.5 mL PBS混合后待ELISA检测。

1.4 数据处理

测定结果均用平均值±标准差表示，采用SPSS statistics 17.0软件对数据进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 间接竞争ELISA条件的优化

在前期实验中，利用DHAM为半抗原合成了DHAA的完全抗原，并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性，获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度[21]。本研究在前期研究的基础上通过优化一系列参数，包括抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数、二抗稀释倍数等，建立白条鸭表皮组织中DHAA残留检测的间接竞争ELISA方法。

采用三维滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及抗体稀释倍数。设置抗原包被质量浓度范围为0.0～4.0 μg/mL，抗体稀释倍数范围为1∶800～1∶12 800。由图1可知，按照OD450 nm接近于1.0所对应实验组合为最佳组合的标准，确定包被抗原质量浓度为1.0 μg/mL，抗体稀释倍数为1∶6 400。

采用单因素控制法，在1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000二抗稀释倍数条件下分别进行间接竞争ELISA分析，按照阳性血清OD450 nm/阴性血清OD450 nm比值最大的选取原则，确立二抗稀释倍数为1∶10 000。

2.2 线性范围、检出限配制质量浓度范围为10～10 240 ng/mL的DHAA标准溶液，在最优条件下进行间接竞争ELISA分析，绘制抑制率曲线。结果表明，线性范围为10～5 120 ng/mL，回归方程为y=26.03x-13.87（R2=0.992），式中：x为标准溶液质量浓度的对数，y为抑制率。

在间接竞争ELISA方法中，最低检测限定义为抑制率10%对应的分析物质量浓度，工作质量浓度范围定义为抑制率20%～80%对应的分析物质量浓度。通過线性回归方程计算可知，方法检测限为8.2 ng/mL，工作质量浓度范围为20.0～4 030.0 ng/mL，抑制率50%时对应的分析物质量浓度为283.8 ng/mL。根据鸭表皮组织的前处理条件，鸭表皮组织中DHAA的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g。根据Zhu Yongzhi等[24]的报道，使用松香脱毛后，鸭表皮组织中的DHAA含量范围为160～3 750 ng/g。因此本研究建立的间接竞争ELISA方法工作质量浓度范围可以满足鸭表皮组织中DHAA的检测需求。

2.3 交叉反应实验

松香是树脂酸混合物，除了AA和DHAA还包括其他树脂酸，如长叶松酸、海松酸、异海松酸等[25-27]，这些树脂酸在松香中含量虽少，但它们都是三环二萜类含氧化合物，可能会和抗体产生反应，从而干扰检验结果[28-29]。通过交叉反应评价本研究建立的间接竞争ELISA方法检测DHAA的特异性。

分别配制质量浓度为1 mg/mL的AA、长叶松酸、海松酸、异海松酸4 种标准储备液，用PBS梯度稀释成系列工作溶液，进行间接竞争ELISA分析，得到抑制率曲线。根据各线性回归方程计算抑制率分别为20%、50%、80%时所对应的标准溶液质量浓度。

由表1可知，AA、长叶松酸、海松酸、异海松酸4 种树脂酸与DHAA的交叉反应率均小于3.00%，表明这些结构类似的树脂酸对DHAA测定的影响很小，可以忽略不计，因此，本研究所建立的间接竞争ELISA检测方法对DHAA具有优良的特异性。

2.4 精密度实验

选择3 个DHAA含量不同的白条鸭样本开展精密度实验，包括日内和日间精密度实验，评价建立的间接竞争ELISA方法的重复性。日内精密度实验在1 d内进行、共设置6 个重复;日间精密度实验每天3 个重复、连续进行4 d实验。

由表2可知，日内和日间精密度实验测定结果为相对标准偏差分别为5.9%～8.7%和5.5%～10.2%，表明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有良好的重复性。

2.5 回收率实验

选择3 个DHAA含量不同的白条鸭样本，进行4 个不同水平的添加回收實验，评价建立的间接竞争ELISA方法的准确度。由表3可知，回收率范围为78.2%～97.2%，表明所建立的间接竞争ELISA检测方法准确度较高。

2.6 实际样品分析

用所建立的间接竞争ELISA方法分别对23 个白条鸭样本中的DHAA含量进行检测，并与HPLC-FLD方法的测定结果进行对比。由表4可知，2 种方法的测定结果无明显差异。ELISA方法测定结果表明，23 个白条鸭样本中，20 个样本检出DHAA，阳性率达87.0%，DHAA含量范围为118.6～1 199.2 ng/g，无论是阳性率还是DHAA残留水平均与Zhu Yongzhi等[30]的报道基本一致。因此，本研究所建立的白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA分析方法准确度高，可以满足流通领域中白条鸭表皮组织中DHAA含量的快速分析。

3 结 论

通过间接竞争ELISA参数的优化，建立白条鸭表皮组织中DHAA含量的间接竞争ELISA测定方法。方法的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20 150.0 ng/g。回收率实验、交叉反应实验及实际样本测定结果表明，本研究建立的间接竞争ELISA方法具有良好的灵敏度和准确度，操作简便、快捷，适用于大样本量的白条鸭中DHAA残留量的分析检测，也可用于市场流通领域中违禁使用松香脱毛加工的白条鸭的鉴别。

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