李凯，王元林，徐元高，储铸钢，徐述雄，石华

(贵州省人民医院 泌尿外科,贵州 贵阳 550002)

膀胱癌是常见的泌尿生殖系统肿瘤，生物学行为常表现为多发、侵袭和复发等，给治疗和预防工作带来了巨大的挑战[1- 2]。目前研究显示，在膀胱移行细胞癌的发生、发展的过程中，常伴有细胞凋亡和增殖过程的异常，其中以调节细胞凋亡的p53蛋白同源物基因PTEN异常表达最为突出[3- 4]。作者将膀胱移行细胞癌患者与良性前列腺增生患者的膀胱组织作对比，探究了PTEN甲基化及p53异常表达与膀胱移行细胞癌发生的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2016年1月至2017年12月收治的71例膀胱移行细胞癌患者作为观察组，患者年龄48～68岁，平均(58.35±8.24)岁；单发性癌灶49例，多发癌灶22例。临床分期：非肌层浸润性48例，肌层浸润性23例；病理分级：G1、G2期52例，G3期19例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移46例。同时选取正常膀胱组织标本(来自良性前列腺增生患者)71例作为对照组，患者年龄47～69岁，平均(57.27±8.61)岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 PTEN甲基化的检测 使用德国Qiagen公司QIAamp DNA FFPE组织试剂盒提取观察组和对照组膀胱组织的DNA，置于-20 ℃保存。应用亚硫酸氢盐对甲基化和非甲基化的DNA标准品进行修饰，并作为甲基化和非甲基化的对照。对两组患者膀胱组织的DNA进行亚硫酸氢盐修饰并提纯，置于-20 ℃保存。根据相关文献[5]，选取外显子556- 971bp高CpG区域，即PTEN基因启动子高度甲基化区域进行甲基化状态的研究。对上述经亚硫酸氢盐修饰处理后的组织进行测序。测序的引物设计如下：PTEN基因甲基化测序的PCR正向排序为：5′- TATAGATTTGGGGGAAGGGGGAATT- 3′,反向排序为5′- CCCTTACCTCTACCCCTAAATTTC- 3′，引物加生物素修饰。按照试剂盒说明书进行扩增。PCR反应总体系：H2O 34.8 μl、5倍缓冲液GC 10 μl、上下游引物各1 μl、全基因组DNA样本2 μl、Taq酶0.2 μl，共48 μl。循环条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，最适温度下退火30 s，72 ℃延伸10 min，总计35个循环，最后在72 ℃的条件下延伸10 min。再将产物进行焦磷酸法测序：在96孔PCR反应板中加入反应结合珠2 μl、结合缓冲液38 μl以及PCR产物40 μl，室温混匀。将结合珠和PCR产物应用真空泵吸出，并依次浸入70%乙醇溶液、0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液和冲洗液中，每次5 s。停用真空泵后取下结合珠与PCR产物，并一同置入40 μl退火缓冲液中，在85 ℃下变性处理2 min，然后将其冷却至室温进行杂交。在仪器中加入底物混合物、反应所需酶以及脱氧核苷酸；将试剂舱和96孔反应板放入焦磷酸测序检测仪中检测，并应用Pyro Q- CpG软件对甲基化位点进行检测。本次实验中检测甲基化率的位点为连续的胸腺嘌呤和胞嘧啶片段，而片段中共有4个胸腺嘌呤和胞嘧啶连续片段，因此，样本中4个胸腺嘌呤和胞嘧啶位点的甲基化率总和即为样本中PTEN基因启动子区甲基化率。

1.2.2 p53蛋白表达的检测 将样本5 μm厚切片，行HE染色和免疫组化染色。免疫组化法应用p53鼠抗人单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术公司提供)。操作步骤参照试剂盒说明书。

1.3 判定标准

p53蛋白染色阳性为黄色或棕黄色染色。在400倍的显微镜下观察3个高倍视野，每个视野中计数100个细胞，并计数平均阳性细胞数及比率。阳性细胞比率<10%为阴性，10%～25%为弱阳性，26%～50%为阳性，≥51%为强阳性。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组PTEN基因甲基化的情况

PTEN基因甲基化率观察组为(21.73±7.92)%，显著高于对照组的(7.54±2.35)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 膀胱癌组织PTEN基因启动子甲基化率与临床病理学的关系

见表1。

表1膀胱癌组织PTEN基因启动子甲基化率与临床病理学的关系

临床病理资料nPTEN基因甲基化率/%t值P值年龄 ≥50岁4920.83±6.580.497>0.05 <50岁2221.06±7.02肿瘤长径 ≤5 cm6019.96±8.331.687>0.05 >5 cm1121.87±8.581.687>0.05组织学分级 0、Ⅰ级4817.62±5.723.112<0.05 Ⅱ、Ⅲ级2322.88±4.97淋巴结转移 阴性4115.74±5.337.064<0.05 阳性3124.35±5.61

表1显示，组织学分级为Ⅱ、Ⅲ级和淋巴结转移阳性的患者，组织PTEN基因启动子甲基化率显著高于组织学为0、1级和淋巴结转移阴性的患者，且差异均有统计学意义(P<0.05)；而年龄、肿瘤长径与PTEN基因启动子甲基化率无关。

2.3 两组患者膀胱组织中p53蛋白表达水平比较

见表2。

表2两组患者膀胱组织中p53蛋白水平比较

组 别np53蛋白表达情况弱阳性阳性强阳性阴性p53表达阳性率/%对照组714316311.27观察组712128101283.10χ2值73.501P值<0.05

表2显示，p53蛋白表达阳性率观察组显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 膀胱癌组织p53蛋白表达与临床病理学关系

见表3。

表3膀胱癌组织p53蛋白表达与临床病理学关系

临床病理资料np53蛋白阳性/例t值P值年龄 ≥50岁4945(91.84%)8.597<0.05 <50岁2214(63.64%)肿瘤长径 ≤5 cm4332(74.42%)5.849<0.05 >5 cm2827(96.43%)组织学分级 0、Ⅰ级3828(73.68%)5.159<0.05 Ⅱ、Ⅲ级3331(93.94%)淋巴结转移 阴性4030(75.00%)4.278<0.05 阳性3129(93.55%)

表3显示，年龄、肿瘤长径及组织学分级、淋巴结转移均与p53蛋白表达有关。

3 讨 论

膀胱癌是常见的泌尿系统肿瘤，其发病率居我国泌尿系统肿瘤的首位，在全球范围内占成年恶性肿瘤的8%，其中膀胱移行细胞癌是最常见的病理类型(占90%)[6- 7]。膀胱癌的发病机制目前仍不明确，目前学术界的主要观点是膀胱癌患者存在原癌基因与抑癌基因尤其是抑癌基因的异常表达。焦磷酸测序方法可以从分子水平上对于DNA序列和甲基化水平进行分析。该方法不但所需样本少，而且具有较好的检测精度。PTEN是10q23染色体上的磷酸酶基因，与张力蛋白同源[8]。PTEN基因的异常表达可导致Cowden综合征、宫颈癌等一系列肿瘤的产生。PTEN基因启动子出现甲基化，激活了PIP3通路，使得细胞的凋亡过程受抑，或进入分裂周期进程，造成细胞分裂增殖的失控，引发癌症。对于PTEN在膀胱癌发生、发展中的作用，目前学术界并无统一结论。本研究发现，膀胱癌组织中的PTEN基因甲基化率显著高于对照组(P<0.05)，提示PTEN基因甲基化与膀胱癌的发生密切相关；组织学分级较高、淋巴结转移为阳性的患者，PTEN基因的甲基化率也明显升高，说明其与膀胱癌的发展有关。

与PTEN基因相似，p53蛋白也是肿瘤学研究的热点。p53蛋白被认为是一个具有多种功能的转录因子。p53基因转录形成2.5 kb的mRNA并最终翻译为393个氨基酸的p53蛋白，是目前被认为与肿瘤的发生、发展最为密切的蛋白。最初认为p53基因是一种癌基因，后研究发现p53基因有两种——野生型和突变型的p53，前者可以抑制过度的细胞增殖从而抑制癌症，而后者则无这一作用，此时细胞的增殖不受抑制，大大提高了癌症发生的可能性[9]。本研究所检测的是半衰期较长的突变型p53，而其在膀胱移行细胞癌组织中的表达显著高于正常的膀胱组织(P<0.05)。提示p53基因的异常表达在膀胱移行细胞癌的发生、进展及转移中均有重要作用，给膀胱移行细胞癌的诊断与治疗提供了新思路，使靶向治疗成为可能[10]。

综上所述，PTEN基因的甲基化和p53蛋白的表达在膀胱移行细胞癌患者中均呈明显的上升趋势，关于两者之间是否存在某种相关性仍需进一步探究。深入探讨膀胱癌可能发生的分子结构异常，对于阐明膀胱癌的发生机制及药物可能的作用机理意义深远。