林燕珊，朱孔博，钱玲林，安丽，慕广建，任利群,

(东南大学附属中大医院1.老年医学科；2.心血管内科,江苏 南京 210009)

他汀类药物即3- 羟基- 3- 甲基- 戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，能够有效降低胆固醇，降低心脑血管疾病死亡率，并已广泛应用于心脑血管疾病的一级预防和二级预防[1- 2]。然而研究[3]发现，瑞舒伐他汀钙治疗后新发糖尿病风险明显增加，之后大量研究进一步证实了他汀类药物致新发糖尿病发生风险增加[4- 5]，并且呈剂量依赖性[6]。3项关于阿托伐他汀钙的大规模随机试验即TNI、IDEAL、SPARCL的研究结果提示，强化他汀治疗增加新诊断糖尿病的风险[7]。尽管应用他汀类药物的获益远远超过其致血糖异常风险，但为了使其临床应用获益最大化，控制心血管事件残余风险，深入研究他汀类药物诱发糖尿病的分子机制十分重要。目前他汀类药物引起糖代谢异常的研究多局限于体外细胞学研究[8- 10]，仍缺乏在体研究的动物模型。本研究建立他汀诱发糖代谢异常的大鼠模型，为进一步研究他汀类药物致糖代谢异常的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

普通大鼠饲料(含碳水化合物45%、蛋白质40%、脂肪10%、其他5%)购自江苏省协同医药生物工程有限公司；阿托伐他汀钙粉剂由诺华山德士(中国)制药有限公司提供(批号：J20130172)；血糖仪、血糖试纸购自德国拜耳公司；大鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒购于安徽巧伊生物科技有限公司，酶标仪为美国Bio- Rad公司。

1.2 实验动物及分组

健康雄性8周龄SPF级Wistar大鼠16只，体重(280±5) g，由扬州大学比较医学中心提供，动物合格证编号(NO.201717658)。所有Wistar大鼠SPF环境饲养，环境温度控制在22～25 ℃，湿度为(55±5)%，光照黑暗循环(光照时间为7：00～19：00)。大鼠适应性饲养1周后采用随机数字表方法随机分为两组，即对照组及阿托伐他汀钙组，每组8只。阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙50 mg·kg-1·d-1灌胃，对照组给予等量去离子水灌胃，两组均干预24周。

1.3 口服葡萄糖耐量试验及胰岛素释放试验

干预大鼠24周后行口服葡萄糖耐量试验，禁食12 h 后剪尾采血测空腹血糖，并留取血清，随后以2 g·kg-1葡萄糖灌胃，分别于30、60、90和120 min时间点采血测血糖，并留取血清。采用ELISA法测量血清胰岛素，并计算稳态模型评价(homeostasis model assessment，HOMA)指数，即胰岛β细胞功能指数(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA- β)=20×空腹胰岛素水平/空腹血糖水平-3.5；胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA- IR)=空腹血糖水平×空腹 胰岛素水平/22.5；胰岛素敏感指数(homeostatic model assessment of insulin sensitivity，HOMA- IS)=1/HOMA- IR。

1.4 检测血生化指标及胰腺组织病理学观察

干预大鼠24周后予10%水和氯醛腹腔注射麻醉,开胸经左心室采血10 ml，离心取血浆检测生化指标。迅速分离胰腺，并在4%多聚甲醛溶液中保存固定24 h，经石蜡包埋，层厚3 μm连续切片，行苏木精- 伊红染色，观察对照组及阿托伐他汀钙组大鼠胰腺组织的组织形态学变化。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 两组大鼠体重及生化指标比较

与对照组比较，阿托伐他汀钙组大鼠体重、甘油三酯(TG)明显降低(P<0.05)，谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(Cr)有升高趋势，而总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL- C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL- C)均有降低趋势，但均无统计学意义。见表1。

组 别体重/gALT/IU·mL-1AST/IU·mL-1Cr/μmol·L-1对照组478.0±11.673.1±6.5177.7±11.757.9±4.0阿托伐他汀钙组423.4±25.178.1±19.0204.9±51.773.7±23.8P值<0.0010.5250.1690.131组 别TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL-C/mmol·L-1LDL-C/mmol·L-1对照组3.08±0.421.72±0.180.53±0.061.99±0.42阿托伐他汀钙组2.77±0.341.37±0.240.47±0.111.76±0.19P值0.1430.0060.2100.194

2.2 两组口服葡萄糖耐量试验比较

两组间空腹血糖比较，差异无统计学意义，但30、60、90和120 min时阿托伐他汀钙组的血糖明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

2.3 两组胰岛素释放试验比较

与对照组比较，阿托伐他汀钙组空腹、30、60、90和120 min的胰岛素分泌水平均明显降低(P<0.05)。见表3。

表2 两组口服葡萄糖耐量试验比较mmol·L-1

表3 两组胰岛素释放试验比较μIU·ml-1

2.4 两组HOMA- β、HOMA- IR及HOMA- IS比较

与对照组相比，阿托伐他汀钙组HOMA- β、HOMA- IR降低，而HOMA- IS升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组 别HOMA-βHOMA-IRHOMA-IS对照组137.56±66.211.87±1.200.67±0.27阿托伐他汀钙组63.96±40.870.89±0.321.27±0.52P值0.0180.0430.011

2.5 两组胰腺组织病理学变化

与对照组比较，光镜下阿托伐他汀钙组胰腺组织形态学未见明显变化,胰岛细胞分布正常，核圆形，胞浆丰富，间质无水肿，无变性坏死。见图1。

3 讨 论

他汀类药物广泛应用于心血管和代谢性疾病的预防或治疗，自JUPITER研究之后大量研究及荟萃分析证实了他汀类药物致新发糖尿病发生风险增高，并且强化他汀治疗比标准剂量更进一步增加新诊断糖尿病的风险[3- 7]。深入研究他汀类药物诱发糖代谢异常的分子机制须借助有效的动物模型。本研究选用Wistar大鼠，在普通饮食基础上采用大剂量阿托伐他汀钙进行24周的长时程干预发现，虽然空腹血糖阿托伐他汀钙组与对照组无差异，但口服葡萄糖耐量试验结果显示阿托伐他汀钙组30、60、90和120 min血糖明显升高，同时空腹和30、60、90、120 min血清胰岛素水平阿托伐他汀组均低于对照组。大剂量阿托伐他汀钙长时程干预后大鼠虽未达到临床糖尿病的标准，但提示大鼠已经出现明显的糖代谢异常，故成功建立了大剂量他汀干预诱发糖代谢异常大鼠的模型。

a.对照组；b.阿托伐他汀钙组

图1胰腺病理图片HE×400

既往其他研究中心也已报道过采用不同的方法建立他汀类药物诱发糖代谢异常的动物模型，但是均存在不同的缺陷。有研究先采用链脲佐菌素损伤胰腺功能后再给予阿托伐他汀钙或普伐他汀6周短时程干预，导致糖耐量受损，但不影响胰岛素分泌[11]；采用小剂量阿托伐他汀钙或普伐他汀干预3周，结果显示阿托伐他汀钙组胰岛素敏感性降低，而普伐他汀并无此现象[12]，提示不同的他汀在致糖代谢异常方面可能存在异质性。采用链脲佐菌素直接损伤胰腺β细胞，与2型糖尿病的发病机制并不完全相同；不同的他汀类药物因分子结构、物理学特性、药代学不同，所以作用存在异质性。阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀钙、辛伐他汀、洛伐他汀和氟伐他汀对患者的糖代谢影响较大，而普伐他汀和匹伐他汀的作用结果则不同[13- 14]。强化他汀治疗可增加新发糖尿病的风险，但与用药时间的长短密切相关，同时伴随其他危险因素可能会发挥增强或抵消的作用。本研究选用临床研究明确能够增加新发糖尿病风险的阿托伐他汀钙，参考之前动物研究[15]，剂量采用50 mg·kg-1·d-1，相当于临床80 mg·d-1的强化他汀治疗，干预时间长达24周，且给予普通饮食，避免了高脂饮食本身对糖代谢的影响。本研究方案避免了既往研究的局限性，更接近人体服用阿托伐他汀钙致糖代谢的异常病理生理过程。胰岛素释放试验血清胰岛素水平阿托伐他汀钙组均低于对照组，而HOMA- β、HOMA- IR降低，HOMA- IS升高，提示他汀干预后胰岛素敏感性增加，改善了胰岛素抵抗，出现糖代谢异常的原因主要为他汀致胰岛β细胞功能障碍所致，这也与临床研究[16]的结论相符。但本研究动物模型未达到临床糖尿病的诊断标准，所以光镜下胰腺组织病理学未见明显变化，而仅出现胰岛β细胞功能改变。

本研究动物模型亦存在一定的不足：模型血糖升高水平未达到临床糖尿病的诊断标准；干预时间还不足够长，胰腺组织病理学未见明显变化，未进行电镜检查，进一步观察超微结构的变化；干预条件单一，与临床上患者同时合并多种基础疾病和危险因素有所不同。

总之，本研究采用大剂量阿托伐他汀钙进行长时程干预，建立了阿托伐他汀钙致糖代谢异常的大鼠模型，成功模拟人体服用阿托伐他汀钙致糖代谢异常的病理生理过程，为深入研究他汀致糖代谢异常的分子机制提供可能性。