刘梦璇，马莉，何岁勤，陈文君，马翔

(大连医科大学附属第一医院 眼科，辽宁 大连 116011)

视网膜Müller细胞是视网膜主要胶质细胞[1]，构成血- 视网膜屏障(blood- retina barrier,BRB)，对维持视网膜正常结构及功能至关重要。年龄相关性黄斑变性(age- related macular degeneration,AMD)为视网膜黄斑区退行性改变，可导致视力下降[2]，主要与氧化损伤有关。氧化损伤可降低Müller细胞活性，破坏BRB完整性，导致AMD发生发展[3- 4]。叶黄素能猝灭氧自由基而发挥抗氧化作用。目前，对氧化损伤致AMD的研究多集中在视网膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)细胞，而对于氧化损伤Müller细胞致AMD的报道甚少。因此，探讨叶黄素保护氧化损伤Müller细胞对防治AMD至关重要。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

将MIO- M1细胞(英国伦敦大学惠赠)加入DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待生长至融合状态用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2 四甲基偶氮唑盐试剂(MTT)实验

将MIO- M1细胞接种于96孔板，实验分为对照组、不同浓度(5、10、50、100、150、200 μmol·L-1) 过氧化氢(H2O2)组及150 μmol·L-1H2O2+不同浓度(10、20、40、60 μmol·L-1)叶黄素的共处理组。每孔加MTT液20 μl，继续培养4 h后加入150 μl二甲基亚砜。置于酶标仪检测光密度(OD)值。MIO- M1细胞活性(%)=(H2O2组或共处理组OD值/对照组OD值)×100%。

1.3 改良细胞划痕实验[5]

将MIO- M1细胞接种于置有硅胶障碍物12孔板，实验分为对照组、不同浓度(10、20、40、60、80 μmol·L-1)H2O2组及40 μmol·L-1H2O2+不同浓度(10、20、30、40 μmol·L-1)叶黄素的共处理组。弃硅胶障碍物，于倒置显微镜(20倍)拍照并应用Image J[5]检测0、24 h细胞迁移面积。MIO- M1细胞迁移率(%)=[(0 h面积-24 h后面积)/0 h面积]×100%。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度H2O2对MIO- M1细胞活性的影响

当H2O2浓度为50～200 μmol·L-1时，与对照组比较，细胞活性显著下降，分别为(84.31±2.33)%、(72.93±4.65)%、(48.12±5.64)%和(21.86±3.51)%，且不同浓度H2O2组之间MIO- M1细胞活性比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。当H2O2浓度为150 μmol·L-1时，近半数MIO- M1细胞死亡。

2.2 叶黄素对H2O2作用于MIO- M1细胞活性的保护作用

与对照组比较，H2O2组和共处理组的细胞活性显著下降，差异均有统计学意义(P<0.001)。当叶黄素处理浓度为40 和60 μmol·L-1时，MIO- M1细胞活性分别为(65.78±3.49)%和(73.54±5.20)%，细胞活性明显高于H2O2组，差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.3 不同浓度H2O2对MIO- M1细胞迁移的影响及叶黄素保护作用

当H2O2处理浓度为40～80 μmol·L-1时，与对照组比较，细胞迁移率显著下降，为(78.76±5.80)%、(57.24±2.69)%和(25.37±5.92)%，且不同浓度H2O2组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.001)。与对照组比较，H2O2组及共处理组的细胞迁移率均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.001)，当叶黄素处理浓度为20～40 μmol·L-1时，细胞迁移率为(73.85±3.77)%、(78.31±5.67)%和(82.43±4.52)%，与H2O2组比较，细胞迁移率明显提高，差异均有统计学意义(P<0.05)(图1)。

A、B、C分别为对照组、H2O2组及H2O2+叶黄素共处理组弃硅胶障碍物0 h的图像，白色虚线所圈范围内为无细胞区域；D、E、F为对应组MIO- M1细胞迁移24 h后图像(Bar=500 μm)

图1H2O2及叶黄素对MIO-M1细胞迁移的影响

3 讨 论

氧化应激是致AMD主要原因之一，近年来对AMD探讨多集中在RPE细胞受损方面，而对AMD模型研究发现，氧化损伤可致Müller细胞受损，使其活性下降并破坏BRB的完整性，进而导致AMD发生发展[3- 4]。作者通过体外给予H2O2，建立MIO- M1细胞氧化损伤模型，观察氧化损伤MIO- M1细胞的影响，结果显示，随H2O2浓度不断增加，MIO- M1细胞活性逐渐下降，呈剂量依赖性，且当H2O2浓度为150 μmol·L-1时，可致接近半数的MIO- M1细胞死亡，有力支持了H2O2可降低细胞活性的报道[6]。给予叶黄素干预后可显著提高MIO- M1细胞活性，进一步验证了杨旭等[7]提出的叶黄素可保护Müller细胞活性的观点。然而，对肝癌的研究发现，叶黄素可降低肝癌HepG2细胞的存活率[8]，这一不同可能是由癌细胞与MIO- M1细胞生长特性不同及对药物敏感度的差异性所致。本研究发现，叶黄素对H2O2氧化损伤MIO- M1细胞具有保护作用，这与叶黄素在机体中发挥抗氧化及抗凋亡作用密切相关。

由于经典细胞划痕法存在局限性，本研究采用改良细胞划痕法[5]检测MIO- M1细胞的迁移率，使结果更为精准，且操作便捷。迁移是细胞对周围环境变化的一种基本反应，对受损组织的修复及再生具有重要作用。已有研究[9]显示，Müller细胞可迁移至受损部位再生，以修复、重建受损的视网膜。Sullivan等[4]对AMD研究发现，Müller细胞可通过细胞迁移延伸拓展至脉络膜，修复受损的BRB，维护其完整性并保证视网膜正常结构及功能。本研究发现，H2O2对MIO- M1细胞迁移的抑制作用随H2O2浓度增加而增强，呈剂量依赖性。加入20 μmol·L-1叶黄素干预后可显著提高MIO- M1细胞迁移率，对AMD起防治作用。Liu等[10]研究发现，叶黄素可下调细胞周期蛋白B1的表达，抑制氧活性(reactive oxygen species,ROS)的产生，保护RPE细胞，而ROS能够损伤线粒体,阻止ATP产生[11]。麦嘉仪等[12]研究发现，叶黄素可降低ROS，提高Na+- K+- ATP酶活性，促进ATP产生。因此，我们推测叶黄素可能通过下调细胞周期蛋白B1，提高Na+- K+- ATP酶活性，抑制ROS并促进ATP产生，从而保护了MIO- M1细胞活性及迁移。

综上所述，本研究表明叶黄素对H2O2作用下MIO- M1细胞活性及迁移具有一定保护作用，并对防治AMD至关重要，但其确切保护机制尚需进一步研究。