吴少敏， 关灵， 郑锐年， 黄素然

东莞市人民医院 1妇产科， 2药物临床试验机构办， 3肿瘤内科(广东东莞 523000)

近四十年，尽管宫颈癌的发病率和病死率在全世界范围内均已明显下降，但其仍然是造成女性死亡的主要肿瘤[1-2]。据2016年世界卫生组织(WHO)统计，每年有大约120 000例女性患者死于宫颈癌[3]。宫颈癌起病隐匿，位置特殊，涉及隐私，患者发现时常常已进展到中晚期，丧失了手术根治的机会[4]。目前，同期放化疗是治疗局部晚期宫颈癌的主要手段之一。研究结果[5-6]显示以顺铂为基础的同步放化疗较单纯放疗可以降低宫颈癌患者的局部复发及远处转移率, 改善患者生存率, 使死亡危险下降 30%～50%。因此，在放疗的同时，加用顺铂为主的化疗，是治疗局部晚期宫颈癌患者的标准治疗方案。但是，研究表明顺铂同期放化疗的治疗效果存在明显个体差异。韩超等[7]研究发现，以顺铂为主的同步放化疗组与单纯放疗组相比，有效率和 5 年生存率均差异无统计学意义(P>0.05)，但是，Ⅲ期以上、病理分级G3、鳞癌的患者5 年生存率可明显延长。Park 等[8]回顾性分析发现，对于老年局部晚期宫颈癌患者，同步放化疗与单纯放疗比较，并不能提高癌症特异生存率。上述研究说明，顺铂在宫颈癌中应用治疗效果存在明显的差异，进而说明部分宫颈癌患者在承受化疗的毒副反应以及经济负担时，却没有得到治疗效果。顺铂是宫颈癌化疗耐药的主要药物之一[9]。其主要与细胞内部DNA发生交联，进而引起DNA单链损伤，从而导致细胞死亡。不同机体应对顺铂引起DNA损伤的差异是影响宫颈癌患者顺铂耐药的主要因素[10-11]。因此，深入探讨DNA损伤应答的个体差异性对指导临床宫颈癌个性化治疗具有重要意义。在机体应对DNA损伤应答的过程中，DNA切除修复交叉互补基因1(ERCC1)是DNA碱基切除修复(NER)途径中的关键酶，可以清除致癌物(如烟草)及抗癌剂(如顺铂)使用所导致的DNA损伤废物[12]。ERCC1的单核苷酸多态性与化疗耐药的关系已有报道，但是C118T与化疗耐药的关系暂无报道[1]。为进一步丰富ERCC1多态性(C118T)与宫颈癌耐药间的临床资料，我们统计了我院诊治的102例晚期宫颈癌患者顺铂化疗疗效，同时检测外周血ERCC1基因多态性(C118T)比例，分析ERCC1基因多态性(C118T)与宫颈癌顺铂耐药间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究连续收录2012年1月至2017年5月东莞市人民医院收治的晚期宫颈癌患者。入组标准：(1)所有患者均行病理学检查确诊；(2)符合NCCN 2017版宫颈癌分期的Ⅱb～Ⅳ期患者；(3)确诊至化疗结束患者未接受手术、放射、生物、中药等其他方法治疗，且化疗过程中未出现其他不良反应；(4)预计寿命大于3个月。入院后完善术前检查，血常规、凝血功能、血生化、心电图大致正常；重要脏器如心、肝、肺、肾等功能良好，无严重合并症，能够耐受化学药物治疗。排除标准：(1)严重恶液质的患者；(2)患有其他严重基础疾病的患者；(3)中途更改治疗方案的患者。并排除化疗前骨髓功能不佳的患者[白细胞计数 <2.0×109·L-1和(或)血小板计数<80×109·L-1]；入组前曾接受过其他方案化疗的患者。共有102例患者最终被纳入研究对象中，年龄31～60岁，中位年龄为49岁，其中Ⅱb期58例，Ⅲ期34例，Ⅳ期10例；鳞癌92例，其中高分化61例，中低分化31例；腺癌10例，其中高分化4例，中低分化6例。所有患者均已签署东莞市人民医院临床试验知情同意书。所有试验步骤均符合东莞市人民医院伦理学规定。

1.2 方法

1.2.1 检查方法 在接受化疗前，均行B超检查测量患者肿瘤大小。每周期化疗结束以及后续随访，均行B超重新测量患者肿瘤大小。根据WHO标准，将肿瘤化疗疗效分为以下几个等级：(1)疾病进展(progressive disease，PD)；(2)疾病稳定(stable disease，SD)；(3)完全缓解(complete response，CR)；(4)部分缓解(partial response，PR)。将CR+PR定义为化疗敏感组；PD+SD定义为化疗耐药组。

1.2.2 化疗方法 所有患者均接受紫杉醇联合顺铂(TP)和紫杉醇联合卡铂TC方案的化疗，21 d为1个疗程，共进行2～3个疗程。

1.2.3 标本采集及DNA提取 患者签署知情同意书后，抽取两组研究对象外周血2 mL，用TIANamp Blood血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化，中国)按说明书提取基因组DNA。

1.2.4 ERCC1基因多态性检测 对各个标本的全血DNA进行PCR扩增。引物合成：ERCC1基因序列从NCBI获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。采用Primer5.0软件设计C118T引物，正向：5′-AGCAGCGCCCTCTGTGGTTATC-3′；反向：5′-AGGCTTCTCATAGAAC-3′。所有引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。PCR反应体系：50 μL，总体系中包含基因组DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，dNTP(0.2 mmol/L) Mixture 8 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+Plus) 5 μL，TaKaRa LA Taq (5 U/μL) 0.5 μL。反应程序均为：94℃预变性3 min，94℃变性1 min，在55℃下退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环，72℃再延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察并拍照，800 bp出现亮带后送北京华大基因公司测序。测序结果用DNASTAR软件包中的Seqman进行序列分析，用其中的MegAlign进行与标准序列的比对，最终计算出化疗敏感组和耐药组的基因型突变频率。

1.3 统计学方法 用SPSS 19.0统计软件，不同组别间采用2检验及t检验，基因型及等位基因间发生化疗耐药的相对危险度用比值比(odds ratio，OR)及95%的可信区间(confidence interval，CI)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

纯合子CC型的基因显著存在于化疗敏感组(P<0.05)；两组间杂合子TC型基因分布差异无统计学意义(P>0.05)；而TT型基因显著存在于化疗耐药组(P<0.05)；化疗耐药组T等位基因频率显著高于化疗敏感组(P<0.05)。提示ERCC1基因(C118T)单核苷酸多态性可能与化疗耐药相关。因此，为进一步探究ERCC1基因的基因型频率及等位基因频率与化疗耐药间的关系，我们分别分析了两组试验者内ERCC1基因(C118T)基因型频率及等位基因频率与顺铂化疗耐药间的相关性。结果显示，相比于化疗敏感组，携带有突变基因T的基因型显著存在于化疗耐药组(P<0.05)；同时，化疗耐药组T等位基因频率显著高于化疗敏感组(P<0.05)。ERCC1基因多态性(C-T突变)与顺铂化疗耐药间差异有统计学意义。见表1～3。

表1 各组ERCC1基因分型 例(%)

表2 ERCC1不同基因型化疗耐药结果例(%)

表3 ERCC1基因等位基因频率化疗耐药结果频数(%)

3 讨论

宫颈癌是影响女性生命健康的主要疾病之一。随着其发病率的日益增长，目前越来越受到医务人员的关注。化疗是中晚期宫颈癌患者的主要治疗手段。顺铂是常用的药物之一。在取得缓解的基础上，多数患者发现存在顺铂耐药，具体表现为宫颈癌患者PD和SD显著延长。因此针对宫颈癌顺铂化疗耐药的研究具有重要社会医学意义。

药物疗效存在个体差异一直是临床常见的现象，也是临床医生关注的问题。随着分子遗传学与分子药理学的发展，人们逐渐认识到不同个体对同一药物的不同反应大多来源于基因的差异。化疗耐药分为固有耐药和继发耐药。前者指患者在服用化疗药物之前就存在对药物的抵抗；而后者则指患者在服用化疗药物的同时，随着服用次数的增多，逐渐出现药物脱敏，即对药物呈现低敏感[13]。两种不同耐药类型，对应不同的干预手段。宫颈癌顺铂耐药为继发耐药，故我们从顺铂对细胞引起的下游信号途径入手。顺铂对肿瘤的细胞毒作用主要是通过形成铂-DNA加合物。顺铂的主要作用靶点是DNA。顺铂进入肿瘤细胞后水解为双氯双氨铂，然后与细胞DNA形成顺铂-DNA加合物，影响细胞DNA的复制与转录，从而导致DNA损伤。顺铂形成的加合物主要是1,2链间交联，少数为1,3链间交联，长链交联剂DNA交联。但不同患者应对顺铂所致DNA损伤修复程度不同，是引起患者间顺铂治疗差异性的主要原因。细胞修复顺铂所致单链损伤的途径主要为DNA碱基切除修复。在此过程中，ERCC1是DNA碱基切除修复途径中的关键酶。该基因定位于染色体 19q13.2～13.3，其正常表达是维持该修复酶功能的分子基础。此酶发生突变，则影响DNA碱基切除修复的程度。研究显示，ERCC1基因可以通过多种方式影响肿瘤耐药。ERCC1低表达常常提示宫颈癌的不良预后[1]。不同的个体由于ERCC1基因存在不同的多态性，其DNA的核苷酸切除修复能力也不同, 从而表现为对铂类药物的敏感性不同。ERCC1核苷酸多态性 C118T已在多种肿瘤，如大肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌的铂剂化疗耐药中起重要作用[14-16]。研究指出，该种核苷酸多态性可以作为多种肿瘤化疗效果的预测因子。为进一步丰富ERCC1多态性与宫颈癌顺铂耐药间的临床资料，我们发现CC型的ERCC1显著存在于化疗敏感组，而TT型基因显著存在于化疗耐药组。进一步显示，与化疗敏感组相比，TT及TC基因型的患者发生耐药的可能性更高，T等位基因携带者更容易发生化疗耐药。而有研究表明，T等位基因是宫颈癌易感的一个风险因素，而在卵巢癌细胞系中，T等位基因与ERCC1 mRNA低表达相关，提示T等位基因可能降低DNA修复能力[17-18]。

遗传多态性可以影响蛋白质的功能、结构、稳定性及折叠。ERCC1基因的多态性同样可以影响其基因表达量，从而在各种肿瘤的化疗反应中起作用。有研究报道，在晚期的非小细胞肺癌中，ERCC1核苷酸多态性C118T与患者对顺铂化疗反应密切相关[19]。与我们的发现一致，CC基因型的患者对化疗敏感的比例要2倍于TT及TC基因型的患者。相反，在一项关于ERCC1核苷酸多态性C118T与进展期卵巢上皮癌患者顺铂化疗敏感性关系的研究中，研究者发现两者并无相关性[20]。因此，对于两者关系的现象确认及潜在机制研究是十分必要的。

同时，本研究尚存在较多局限性。首先，研究样本仅包含102例患者，样本含量相对偏少；其次，仅仅将化疗的疗效作为观测的指标，而缺乏无病生存期及总生存期的数据，无法对该基因多态性与疾病总体进展进行分析；再次，患者在化疗过程中，其病理分化水平，是否结合其他治疗方式及护理水平等因素同样应该被考虑到最终结果的有效性中。最后，单一基因的核苷酸多态性往往伴随其他的基因突变共同对化疗耐药起作用。

综上所述，本研究通过比较102例患者外周血ERCC1核苷酸多态性C118T与宫颈癌顺铂耐药间的关系，发现该多态性与顺铂化疗耐药间具有显著的统计学差异，进一步丰富ERCC1多态性C118T与宫颈癌顺铂耐药间的临床资料，并为今后宫颈癌个体化治疗提供了更多理论支撑。