桂 兰， 于瑞涛， 吴 楠， 王卫东， 梅丽娟∗

（1. 中国科学院西北高原生物研究所， 中国科学院藏药研究重点实验室， 青海省藏药研究重点实验室，青海 西宁810008； 2. 中国科学院大学， 北京100049）

乳白香青Anaphalis lactea Maxim. 为菊科香青属多年生草本植物， 主要分布在甘肃南部、 青海及四川西北部， 在青海为民间草药， 又名“哇日多罗”， 可治头痛［1］， 具有祛痰、 止血活血、 祛风湿、 消痞瘤、 平肝潜阳、 平喘， 以及治疗风寒感冒、 胃溃疡等功效［2-3］， 主要含有黄酮类、 皂苷类、 萜类等成分［4］， 其中黄酮类化合物有抗肿瘤、 抗氧化、 抗辐射等作用［5-6］。 前期报道， 乳白香青总黄酮具有很好的的抗氧化活性［4，7］； 袁彦平等［8］对乳白香青煎剂、 蒸馏液、 黄酮和全草注射液进行了动物实验研究， 发现黄酮类化合物具有一定的镇咳作用和比较明显的祛痰作用。 根据质量标志物（Q-marker） 新概念［9］并参考相关研究［10］，黄酮醇苷为乳白香青中主要活性成分， 故本实验将其作为该药材的Q-marker。

目前， 国内报道黄酮醇苷含有量的检测方法主要有紫外分光光度法［7，11］、 薄层扫描法、 HPLC 法、 荧光分光光度法、 毛细管电泳法等， 本实验采用HPLC 法， 具有分离效率高、 分析速度快、 灵敏度高等特点［12］。 另外， 对乳白香青总黄酮醇苷的研究较少， 并且尚无通过HPLC 法测定其含有量的报道， 故本实验建立该方法测定该成分含有量，以期为乳白香青质量评价与开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20A 高效液相色谱仪［岛津企业管理（中国） 有限公司］； XS105 电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； HH-4 恒温水浴锅 （常州国华电器有限公司）；UPI-1-520T 超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.2 试药 槲皮素 （批号1100812200205， 含有量＞98%）、 山柰素（批号1108612200606， 含有量＞98%）、 异鼠李素（批号1108612200407， 含有量＞98%） 对照品（中国食品药品检定研究院）。 9 批乳白香青于2011 年7 ～8 月采自青海省， 经中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟研究员鉴定为正品（具体信息见表1）。 甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）； 其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Unitary C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相甲醇-0.4% 磷酸水（45 ∶55）， 等度洗脱（50 min）； 柱温35 ℃； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长365 nm； 进样量10 μL。 色谱图见图1。

表1 样品信息

图1 各成分HPLC 色谱图

2.2 供试品溶液制备 精密称取干燥过筛的药材粉末约0.21 g， 置于250 mL 圆底烧瓶中， 加甲醇-25%盐酸（4 ∶1） 混合溶液10 mL， 称定质量， 加热回流60 min， 甲醇-25%盐酸（4 ∶1） 补足减失的质量， 摇匀， 滤过， 取续滤液， 即得。

2.3 对照品溶液制备 分别精密称取槲皮素、 山柰素、 异鼠李素对照品3.02、 4.84、 3.20 mg， 置于50 mL 量瓶中，加甲醇40 mL， 超声处理5 min， 甲醇稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤， 即得， 4 ℃保存， 备用。

2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.05、 0.5、1.0、 2.5、 5.0、 10 mL， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 摇匀， 在“2.1” 项色谱条件下测定3 次。 以峰面积为纵坐标（Y）， 溶液质量浓度为横坐标（X） 进行线性回归， 结果见表2， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL， 在“2.1”项色谱条件下测定， 测得槲皮素、 山柰素、 异鼠李素峰面积RSD 分别为0.61%、 0.96%、 0.53%， 表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液， 于0、 2、4、 8、 12、 24 h 在“2.1” 项色谱条件下测定， 测得槲皮素、 山柰素、 异鼠李素峰面积RSD 分别为1.37%、 2.38%、2.63%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一批药材5 份， 每份约0.21 g， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 过滤， 精密吸取10 μL，在“2.1” 项色谱条件下测定， 测得槲皮素、 山柰素、 异鼠李素含有量RSD 分别为2.71%、 1.53%、 2.42%， 表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密量取各成分含有量已知的供试品溶液9 份， 精密加入一定量对照品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下测定， 计算回收率， 结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝9）

2.9 样品含有量测定 取不同产地药材各5 份， 按“2.2”项下方法制备供试品溶液， 过滤， 精密吸取10 μL， 在“2.1” 项色谱条件下测定， 计算含有量， 同时计算总黄酮醇苷含有量［（槲皮素含有量＋山柰素含有量＋异鼠李素含有量） × 2.51］［13］， 结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（mg／g， n＝5）

3 讨论

本实验考察了不同比例甲醇-0.4% 磷酸 （50 ∶ 50、48 ∶52、 45 ∶55）， 发现两者比例在45 ∶55 时， 各色谱峰的分离度、 对称性和理论塔板数良好， 结果可靠。 在2015年版《中国药典》 中， 槲皮素、 山柰素、 异鼠李素的最大吸收波长均在365 nm 左右， 此波长下色谱峰响应较高， 与其他杂质峰分离度符合要求， 故本实验确定其作为检测波长。

实验结果显示， 不同产地乳白香青中3 种黄酮醇苷的含有量明显存在差异， 其中共和县、 互助县南门峡、 祁连县冰大坂产者依次为槲皮素＞山柰素＞异鼠李素； 天峻县舟群乡、 玛沁县果洛军牧场、 互助县北山、 祁连县卓尔山、祁连县阿柔乡、 祁连县油葫芦沟产者依次为山柰素＞槲皮素＞异鼠李素； 仅天峻县舟群乡、 玛沁县果洛军牧场、 共和县、 互助县南门峡产者检测出异鼠李素， 而且含有量很低； 总黄酮醇苷含有量依次为玛沁县果洛军牧场＞天峻县舟群乡＞共和县＞互助县北山＞祁连县冰大坂＞祁连县卓尔山＞互助县南门峡＞祁连县油葫芦沟＞祁连县阿柔乡， 并且前2个产地药材中该成分含有量均高于《中国药典》 规定的银杏叶总黄酮醇苷含有量［13］。 由此可知， 乳白香青中总黄酮醇苷含有量与海拔高度不呈线性关系， 可能与其生长环境有关。