Eltayeb Mohamed Eltayeb Elhassan，牛 欣，苏亚丽，陈守坤，李海峰

(旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学 农学院,陕西杨凌 712100)

植物在生长发育过程中可能会受到高温、低温、干旱、高盐等不同环境胁迫。转录因子通过调控下游靶基因的表达，影响一系列生理生化反应，在非生物胁迫的应答过程中发挥关键作用[1]。植物特有的转录因子DREB(Dehydration responsive element binding protein)保守的AP2结构域与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合，诱导下游基因的表达，提高植物对非生物胁迫的耐受性[2-6]。

DREB基因在高等植物中广泛存在，目前已从拟南芥[6-7]、水稻[8]、小麦[9]、大麦[10]等物种中分离得到了DREB基因。越来越多的证据显示，DREB基因在植物抗逆过程中发挥重要功能。在拟南芥中过量表达拟南芥DREB1/CBF基因，提高了转基因植株对低温、干旱和氧胁迫的耐受性[11]； 在拟南芥中过表达OsDREB1A，转基因植株对高盐和低温胁迫的抵抗力增强[8]。过表达GmDREB1的转基因小麦对盐胁迫表现出更高的耐受性，幼苗期根长、鲜质量和分蘖数与野生型相比更高[12]。

二穗短柄草具有生命周期较短，植株较小，易种植，基因组较小，自花授粉和转化效率高等特点，成为新型的禾本科模式植物[13-15]。二穗短柄草有很多CBF家族基因[16-17]，但有关BdDREB的功能研究还很少。本研究以二穗短柄草Bd21为材料，克隆得到BdDREB1G基因，分析不同物种中的同源蛋白质序列和进化关系和基因的表达模式，构建过表达载体，转化得到了拟南芥，为该基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验中所用植株为二穗短柄草Bd21。将二穗短柄草种子置于人工气候箱中催芽萌发(26 ℃，16 h光照/8 h黑暗)。在培养皿上培养1周后，移栽至营养土中。4 ℃春化2周后，转入西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室人工气候室(26 ℃，16 h光照/22 ℃，8 h黑暗)。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及引物设计 从Gramene网站[18]上BLASTP检索同源蛋白，用DNAMAN软件进行多重序列比对，用MEGA 6.0软件NJ法构建系统发育树。使用Primer Premier 5.0软件设计引物，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 表达模式分析 对2周大的幼苗进行质量分数为20% PEG6000(模拟干旱)、200 mmol/L的NaCl(模拟高盐)、100 μmol/L的ABA、20 μmol/L的6-BA、1 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA(模拟激素胁迫)、45 ℃、4 ℃处理2 h，分别采集取幼苗根或者叶片，同时采集抽穗期植株的根、茎、叶片和花，提取总RNA。RNA提取参考Trizol(TAKARA)说明书。使用罗氏反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA第一链。qRT-PCR使用SYBR Premix ExTaq(TAKARA)试剂盒，按照说明书操作。反应体系、扩增条件及数据分析参考窦艳华等[19]研究。

1.2.3 过表达载体构建 KOD高保真酶(TOYOBO)进行PCR扩增目的片段。用NcoⅠ和PmacⅠ将pCAMBIA1301过表达载体双酶切，将线性化载体与目的片段用重组酶(Vazyme)进行连接，转入大肠杆菌E.coli中。具体参考一步克隆法说明书。通过菌落PCR及双酶切进行鉴定，并经测序(上海生工)确认后，选择阳性克隆提取质粒，经冻融法转入农杆菌GV3101感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆。

1.2.4 拟南芥转化及转基因植株筛选、鉴定和表型观察 用蘸花法侵染拟南芥，收获种子后晒干。用体积分数为70%乙醇及质量分数10%次氯酸钠对种子进行消毒后4 ℃处理3 d，播种于含40 mg/L潮霉素的1/2MS培养基上。黑暗培养3 d后，在光照16 h/黑暗8 h条件下培养2周。待幼苗长至4～6 叶期时移至土壤中，继续光照16 h/黑暗8 h培养，观察表型。

2 结果与分析

2.1 序列分析

NCBI上BLASTP结果显示，BdDREB1G含有一个保守DREB结构域，属于DREB转录因子家族(图1)。与黑麦CbfI-1(SecalecerealecultivarLo7 CbfI-1，KY780081.1)、小麦CBFI(TriticumaestivumAP2 domain CBF protein，CBFI，JN987191.1)、大麦CBF1(Hordeumvulgaresubsp.SpontaneumCBF1，JF796655.1)和粗山羊草DREB1G(Aegilopstauschiisubsp.TauschiiDREB1G，XM_020337958.1)的一致性分别为81%、81%、79%和79%。编码区不存在内含子，序列长度684 pb，编码227个氨基酸。预测其分子质量为24.18 ku，等电点为5.87，负电荷残基总数28，正电荷残基总数24，亲水性平均系数为-0.486，提示该蛋白质可能为亲水性蛋白质。

图1 BdDREB1G保守结构域Fig.1 Conserved domain of BdDREB1G

将BdDREB1G的CDS序列在NCBI中进行BLASTN比对发现，其与小麦、燕麦、黑麦、大麦等禾本科植物中的DREB转录因子序列具有较高的同源性。将拟南芥(AtCBF1，NP_567721.1；AtCBF2，ABV27118.1；AtCBF3，ABV27138.1；AtCBF4，NP_200012.1)、水稻(OryzasativaJaponica DREB1G，XP_015624757.1)、二穗短柄草(CBF1，AFD96407.1；CBF2，AFD96408.1；CBF3，AFD96409.1；CBF4，AFD96410.1；CBF5，AFD96411.1；CBF6，AFD96412.1)、粗山羊草DREB1G、玉米(ZeamaysDREB1A，NM_001157386.2)、小麦CBFI、一粒小麦(TriticummonococcumCBF15，EU076383.1)、大麦CBF1、燕麦(AvenasativaCBF1，AM071406.1；CBF2，AM071407.1)、黑麦CbfI-1、高粱(SorghumbicolorDREB1G，XM_002454439.2)、慈竹(NeosinocalamusaffinisDREB1，JN896707.1)、谷子(SetariaitalicDREB1G，XM_004953380.4)中的DREB同源蛋白质序列与BdDREB1G进行系统发育树分析，图2结果显示，BdDREB1G与AetDREB1G，TaCBF1，HvCBF1和ScCbfI-1在同一个分支上，它们都属于早熟禾亚科且具有较近的亲缘关系的结论一致；与拟南芥的CBF1、CBF2、CBF3和CBF4聚类于A-1亚组中，提示BdDREB1G可能具有A-1亚组蛋白质功能。

DREB蛋白质多重序列比对结果显示(图3)，在BdDREB1G含有N-末端一段保守的AP2结构域，2个CBF特征基序(PKKR/PAGR和DSAWR基序)和一个C-末端的酸性结构域，且在PKKR/PAGR基序的第7位精氨酸(R)和第10位的苯丙氨酸(F)，及AP2结构域的第14位缬氨酸(V)和谷氨酸(E)高度保守。

图2 DREB蛋白质系统发育树Fig.2 Phylogenic tree of DREB proteins

2.2 非生物胁迫处理及不同组织中的表达模式分析

由图4可知，根据实时定量PCR的结果，BdDREB1G在抽穗期的二穗短柄草不同组织中表达不同，其中茎中表达量最高，其次是叶片和根，在花序中表达量最低。不同非生物胁迫处理后其表达水平也有差异。其中，水杨酸处理强烈诱导其表达，高温和低温处理后表达量也显著上升。干旱胁迫、ABA、6-BA及MeJA处理则对该基因的表达无显著影响。提示BdDREB1G可能参与温度胁迫应答及SA信号转导途径，与拟南芥中的同源蛋白质CBFs可能具有相似的功能。

2.3 过表达载体构建

为了初步研究BdDREB1G基因的功能，构建过表达载体。首先运用RT-PCR扩增到了目的片段(图5-A)，电泳图中目的条带大小与预期一致；切胶回收后与过表达载体pCAMBIA1301进行重组反应，然后转化到大肠杆菌中。菌落PCR结果表明得到了阳性克隆(图5-B)。选取阳性克隆提取质粒，进行NcoⅠ 单酶切验证，电泳结果显示，除质粒带以外，在250 bp与500 bp之间出现一条带，与基因内366 bp处含有一个NcoⅠ 的酶切位点一致(图5-C)，表明已经成功构建了BdDREB1G的过表达载体。

图4 BdDREB1G在不同非生物胁迫下及不同部位中表达水平Fig.4 Expression levels of BdDREB1G under different abiotic stresses and in different tissues

A.RT-PCR扩增BdDREB1GAmplification ofBdDREB1Gvia RT-PCR； B.菌落PCR结果 Results of Colony PCR；1～6.6个单克隆 Different clones；7.阳性对照 Positive control；8.阴性对照 Negative control；C.单酶切验证NcoⅠ single restriction digestion of recombined plasmid;M.marker 2000

图5表达载体构建
Fig.5Constructionofoverexpressionvectors

2.4 转基因拟南芥鉴定和表型观察

提取拟南芥叶片总DNA，经过PCR鉴定，可以检测到特异条带，确定为过表达转基因植株(图6)。经过筛选鉴定，共获得11株转基因拟南芥植株。经表型分析，其中OE-BdDREB1G-4和OE-BdDREB1G-72个株系的表型最强，与野生型植株相比，均表现出生长迟缓、植株矮小和晚花的表型(图7)。转基因植株的抗逆性能有待于进一步分析。

M.DNA marker 2000;1,4,7.代表3个不同编号株系的DNA验证结果 The results of DNA verification of three differenet strains;PC.阳性对照 Positive control;NC.阴性对照 Negative control

图6转基因拟南芥PCR鉴定
Fig.6PCRidentificationoftransgenicArabidopsis

3 讨 论

AP2/DREB家族成员都含有一段长约60个氨基酸的保守AP2结构域，可以与DNA结合，尤其是第14位的缬氨酸(V14)和第19位的谷氨酸(E19)可能影响CBF/DREB对CRT元件的结合活性。而CBF1转录因子的N-末端AP2结构域的上游都含有一段碱性氨基酸序列PKKR/PAGRXKFXETRH模体，具有核定位功能，可能与蛋白质运输相关[20-21]；C-末端含有一段酸性活化区域DSWAR模体[22]。本研究分析了二穗短柄草DREB1G的氨基酸序列，发现该蛋白质含有一段63个氨基酸组成的高度保守的AP2结构域，N-末端有核定位信号肽PKRRAGRTKFKETRHP，C-末端含DSPR，而在这些结构域外的氨基酸序列没有显著同源性，这与前人研究一致[23-24]。不同位置氨基酸序列的保守性及多样性可能与其功能相关。

进化分析显示，BdDREB1G与粗山羊草、小麦、大麦和黑麦中的CBF/DREB蛋白质处于同一分支上，提示这些蛋白质可能具有相同的祖先来源，与这几种植物都属于早熟禾亚科且具有较近的亲缘关系的结论相符。BdDREB1G与拟南芥CBF1/2/3/4在同一分支上，提示可能与之具有相似的功能。

拟南芥CBF1/2/3基因受到低温诱导表达[6]，CBF4基因受到干旱诱导表达[7]。与此相似，在本研究中，BdDREB1G受到干旱诱导后表达量显著下降，在高温、低温胁迫后表达量显著上升，提示BdDREB1G可能在植物响应干旱、低温和高温过程中起重要作用。

图7 转基因拟南芥的表型Fig.7 Phenotypes of transgenic Arabidopsis lines

CBF/DREB是非生物胁迫应答过程中一类关键的转录因子，可以调控下游基因的表达改变植株的抗逆性，为通过转基因技术改良植物抗逆性提供更多选择[25]。过量表达DREB1/CBF基因的植株在改变抗逆性的同时，植株的生长也可能受到抑制。过表达AtDREB1A和OsDREB1A的转基因拟南芥的抗低温和抗旱性增强，但在正常生长条件下，生长严重受阻[8,26]。将OsDREB2A在拟南芥中过量表达，植株生长受到抑制，显著矮化[26]。与此相似，在本研究中，过量表达BdDREB1G的转基因拟南芥也表现出严重矮化、生长迟缓、晚花的表型。可能是因为DREB1B/CBF通过影响GA代谢失活，钝化酶降低了GA的活性，从而使转基因植株生长迟缓[27-28]。而在过表达一个受DREB1A调控基因的转基因拟南芥中，多个参与光合作用和碳水化合物代谢的基因的表达受到抑制，这也可能引起转基因拟南芥的生长抑制[29]。

4 结 论

本研究克隆了二穗短柄草中的DREB1G基因，编码一个含227个氨基酸的蛋白质，含有一个典型的AP2保守结构域，属于CBF转录因子亚家族。BdDREB1G基因受到高温、低温或SA胁迫后表达量与对照相比显著上调。将其在拟南芥过量表达，通过潮霉素筛选获得转基因植株，与野生型拟南芥相比，转基因植株明显表现出生长迟缓、植株矮小且晚花，提示BdDREB1G可能参与植物生长发育和开花的调控。