辛世杰，王晓慧，戴国俊，*，安婷婷，张 涛，张跟喜，谢恺舟，王金玉，王宏胜

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009； 2.江苏省动物遗传育种与分子设计重点实验室，江苏 扬州 225009； 3.江苏京海禽业集团有限公司，江苏 海门 226100)

据估计，全球每年因球虫病造成的经济损失超过30亿美元[1-2]，其中至少70%的经济损失是由球虫病的亚临床症状引起的群体生产性能降低所导致，这其中包括个体的生长阻滞和饲料转化率的降低，24%是由于药物预防和治疗所增加的开支[3]。

林雨鑫[4]利用京海黄鸡鸡柔嫩艾美尔球虫(Eimeriatenella)抗性和易感性不同的群体，进行转录组测序，发现细胞因子-细胞因子受体互作通路中富集的差异基因有IL-6、IL-8、IL-12β、IL15、IL-17和TGFB2。其中白细胞介素6(IL-6)是一种多功能细胞因子，在许多炎症急性期反应、自身免疫性疾病和造血作用机制中起着至关重要的作用，尤其是炎症性肠病[5]。Neurath等[6]研究发现，IL-6信号通过诱导Jak/STAT-3和Ras/Erk/C/EBP途径在控制T淋巴细胞的分化和活化中起关键作用。白细胞介素8(IL-8)是鸡机体内重要的趋化因子，可通过与免疫细胞上的受体CXCR1结合，将免疫细胞趋化至患处活化后，参与免疫反应，实现免疫细胞的抵抗功能，并能促进创伤愈合，它与急、慢性炎症性疾病和自身免疫病密切相关[7]。研究表明，IL-8和pcDNA3-lE疫苗同时免疫时可以显著抑止球虫的复制[8]，可作为佐剂在鸡艾美耳球虫DNA疫苗中应用。CC趋化因子配体2(chemokine C-C motif 2，CCL2)是趋化因子CC亚家族中的一员，也是炎症反应的启动子，可以与其受体CCR2结合，促使单核细胞迁移[9]。方强[10]研究发现，在肠炎沙门氏菌感染后2和4 h，鸡体内脾脏和盲肠扁桃体中IL-1p、IL-6、IL-8和CCLi2的mRNA表达量均有不同程度的升高。因此开展鸡IL-6、IL-8和CCLi2基因的表达调控研究，对探究3个基因的表达与球虫病之间的关系具有十分重要的意义。

本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测京海黄鸡Eimeriatenella球虫感染组和非感染对照组脾脏和盲肠中前炎性细胞因子IL-6和趋化因子IL-8、CCLi-2的mRNA相对表达量，分析3个基因表达量在感染与非感染群体间的差异，以及3个基因表达量的相关性，以期为后续鸡球虫抗性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

试验个体来自江苏京海禽业集团有限公司，刚出壳的80只雏鸡(Gallusgallus)随机平均分为两组，在未落地之前饲养于火焰消毒的无球虫笼舍中，饲喂不含抗球虫药剂的饲料，自由饮水。30日龄时对感染组的40只鸡每只灌饲2.5万个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，对照组的40只鸡灌饲等量的生理盐水。

1.1.2 组织样本采集

感染后第7天进行屠宰，采集感染组和对照组所有鸡的脾脏和盲肠的组织样置于冻存管中，现场立即液氮保存，后转移至-70 ℃冰箱保存。

1.1.3 主要实验试剂与耗材

PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premxi ExTaqⅡ、Trizol、Rnase-Free Water等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；DEPC、甲醛、异丙醇、氯仿、氢氧化钠、乙酸钠、EDTA、无水乙醇、无酶枪头、无酶PCR管和冻存管等均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；荧光定量PCR专用光学封板膜(高透明)、0.2 mL半裙边96孔PCR板(透明)购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡组织总RNA的提取和检测

用Trizol法提取鸡组织的总RNA。用微量紫外可见分光光度计对提取的京海黄鸡组织总RNA进行D值测定，凡RNA样品D260/D280值在1.8～2.0说明RNA纯度较高，可以进行下一步实验，若低于1.8说明提取的RNA可能存在蛋白质或酚类物质的污染，然后将京海黄鸡各组织总RNA提取效果通过甲醛变性凝胶电泳进行检测，在紫外光下观察RNA条带情况。将合格样品稀释至100 ng·μL-1，-70 ℃保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR引物设计及合成

根据GenBank中已公布的鸡的IL-6、IL-8和CCLi2基因序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件设计3个目的基因的qRT-PCR引物，内参基因GAPDH和β-actin的引物参照方强[10]设计的引物。引物选择跨内含子设计，以避免DNA的污染，引物由上海生工公司合成，引物设计详细信息见表1。

1.2.3 cDNA的合成

按照PrimeScript RT Master Mix(perfect Real Time)试剂盒说明书将提取的总RNA进行反转录，反转录体系的配置在冰上进行，反应体系为40 μL，体系包括5×Prime Script RT Master Mix 8 μL，组织总RNA 2 000 ng，Rnase-Free Water补足至40 μL。反应的条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

表1荧光定量PCR引物

Table1Quantitative real-time PCR primers used in this study

目的基因Gene引物名称Primer name引物序列Primer sequence(5'→3')产物长度Amplification size/bp登录号GenBank accession No. IL-6FCAAGGTGACGGAGGAGGAC254AJ309540RTGGCGAGGAGGGATTTCTIL-8FGGCTTGCTAGGGGAAATGA136AJ009800RAGCTGACTCTGACTAGGAAACTGTCCLi2FGGCAGACTACTACGAGACCAACAG70L34553RACGGCCCTTCCTGGTGATGAPDHFGGTGGTGCTAAGCGTGTTAT264K01458RACCTCTGTCATCTCTCCACAβ-actinFACACGGTATTGTCACCAACT263L08165RTAACACCATCACCAGAGTCC

1.2.4 目的基因和内参基因引物的PCR扩增检测

反应体系为20 μL，包括：10×Buffer 2.0 μL、25 mmol·L-1Mg2+2.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.8 μL、上下游引物(10 mmol·L-1)各1 μL、DNA模板1 μL(100 ng)、5 U·μL-1Taq酶0.2 μL、ddH2O 11.8 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸35 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min，最后4 ℃保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段。

1.2.5 实时荧光定量PCR

采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量分析。配置20 μL，具体反应体系为：SYBR Premxi ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ染料0.4 μL，模板cDNA 2 μL，加灭菌蒸馏水6 μL补全至20 μL即可。

荧光定量PCR的反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环；之后采集多个信息点进行熔解曲线分析，程序为：95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s，60 ℃，15 s。每个样品做3个重复。

1.3 数据处理与统计分析

荧光定量的结果采用2-ΔΔCt法进行处理分析。使用SPSS18.0软件对目的基因在不同组织间的相对表达量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 京海黄鸡组织总RNA提取结果

将提取好的总RNA通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示总RNA的28S和18S条带明亮、清晰、锐利(图1)，并且用微量紫外分光光度计对提取的RNA检测显示样品D260/D280值在1.8～2.0说明RNA纯度较高，可以进行下一步实验。

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis figure of total RNA

2.2 IL-6、IL-8和CCLi2基因在实验组与对照组京海黄鸡的脾脏和盲肠中的差异表达分析

由图2-a、b、c可见，IL-6、IL-8和CCLi2基因在京海黄鸡感染和对照组的脾脏和盲肠组织中均有表达。在脾脏组织中，感染组中IL-6、IL-8和CCLi2三个基因的相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)，其中IL-6基因表达量在感染组与对照组间达到了差异极显著(P<0.01)；在盲肠组织中，IL-6、IL-8和CCLi2基因表达量感染组均极显著(P<0.01)高于对照组。

由图2-d、e、f可见，除对照组IL-6基因在盲肠和脾脏组织中的表达量差异不显著(P>0.05)外，其他基因无论在对照组还是感染组，相对表达量差异均达到了显著或极显著的水平(P<0.05或P<0.01)，而且盲肠中各基因的表达量均高于脾脏。

2.3 脾脏组织中IL-6、IL-8和CCLi2基因表达的关联分析

由表2可以看出，在感染组脾脏组织中，IL-8基因的表达与IL-6基因存在极显著的正相关(P<0.01)，CCLi2基因的表达与IL-6、IL-8基因存在极显著的正相关(P<0.01)，因此这3个基因在感染组脾脏组织中都呈极显著正相关(P<0.01)；在对照组脾脏组织中，IL-6基因与IL-8基因存在不显著的正相关(P>0.05)，但是IL-8、IL-6基因与CCLi2基因存在极显著的正相关(P<0.01)。

2.4 盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2基因表达的关联分析

由表3可以看出，在感染组盲肠组织中，IL-6基因的表达与IL-8、CCLi2基因呈极显著的正相关(P<0.01)，IL-8基因的表达与CCLi2基因相关性不显著(P>0.05)；在对照组盲肠组织中，IL-6基因与IL-8和CCLi2基因之间存在极显著的正相关(P<0.01)，IL-8基因与CCLi2基因也存在极显著的正相关(P<0.01)。

a、b、c，同一组织不同组别各基因相对表达量的比较；d、e、f，同一组别不同组织各基因相对表达量的比较。*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。a,b,c, Comparison of the relative expression of genes in the same tissue of different groups; d,e,f, Comparison of the relative expression of genes in different tissues of the same group.* meant significant difference(P<0.05)， ** meant extremely significant difference(P<0.01).图2 IL-6、IL-8、CCLi2基因在感染组与对照组京海黄鸡的脾脏和盲肠中表达的差异比较Fig.2 Comparison of the expression of IL-6， IL-8， CCLi2 genes between spleen and caecum in infected group and control group of Jinghai Yellow Chicken

表2感染组和对照组脾脏中3个基因表达的相关性分析

Table2Correlation analysis of three genes expression in spleen of infected and control groups

基因GenesIL-6IL-8CCLi2IL-610.475**0.579**IL-80.26110.890**CCLi20.853**0.996**1

上三角数据为感染组基因表达相关系数，下三角数据为对照组基因表达相关系数；右上角标“*”表示相关性显著(P<0.05)，“**”表示相关性极显著(P<0.01)，无标注表示相关性不显著(P>0.05)。下同。

The upper triangular data was the correlation coefficient of gene expression in infected group， and the lower triangular data was the correlation coefficient of gene expression in control group. * meant significant correlation(P<0.05)， ** meant extremely significant correlation(P<0.01)， no subscript meant no significant correlation(P>0.05). The same as below.

2.5 脾脏和盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2基因表达的关联分析

由表4可以看出，感染组盲肠IL-6基因与脾脏中IL-6、IL-8和CCLi2均存在不显著的正相关(P>0.05)，盲肠IL-8基因与脾脏中IL-8和CCLi2也存在不显著的正相关(P>0.05)，盲肠IL-8基因与脾脏IL-6基因存在不显著的负相关(P>0.05)，盲肠CCLi2基因与脾脏中IL-6、IL-8和CCLi2均存在不显著的负相关(P>0.05)；对照组脾脏中的IL-6、IL-8和CCLi2与盲肠中的IL-6、IL-8和CCLi2之间相关性均不显著(P>0.05)，而且在对照组只有盲肠中CCLi2基因与脾脏中IL-8、CCLi2之间存在不显著的正相关(P>0.05)，其他各基因之间均存在不显著的负相关(P>0.05)。

表3感染组和对照组盲肠中3个基因表达的相关性分析

Table3Correlation analysis of three genes expression in caecum of infected and control groups

基因GenesIL-6IL-8CCLi2IL-610.639**0.469**IL-80.667**10.324CCLi20.498**0.765**1

表1感染组与对照组的脾脏和盲肠中3个基因表达的相关性分析结果

Table4Correlation analysis of three genes expression in spleen and caecum of the infected and control groups

盲肠Caecum感染组Infection group脾IL-6Spleen IL-6脾IL-8Spleen IL-8脾CCLi2Spleen CCLi2对照组Control group脾IL-6Spleen IL-6脾IL-8Spleen IL-8脾CCLi2SpleenCCLi2IL-60.0910.0620.297-0.284-0.146-0.113IL-8-0.0140.1690.203-0.380-0.101-0.067CCLi2-0.162-0.110-0.023-0.4420.1940.207

正值表示正相关；负值表示负相关。

“+” meant positive correlation; “-” meant negative correlation.

3 讨论

鸡没有淋巴结，只有原始的淋巴组织，鸡盲肠扁桃体、脾脏等对免疫应答的产生起支配作用，而且从4日龄起，鸡脾脏中的T淋巴细胞开始具备增殖及免疫功能，30日龄时较为完善[11]。因而我们选择30日龄后的雏鸡口饲柔嫩艾美尔球虫后耐过第7天的鸡来检测3个基因在脾脏和盲肠中的表达量，从而研究经感染后耐过的鸡体内3个基因表达量与球虫感染之间的关系。

刘伟杰等[12]在鸭源NDV激活鸡先天性免疫应答的比较研究中发现，感染后鸡的IL-6在12、24和48 h表达量分别为正常值的0.157倍、4.084倍和0.052倍，呈现先下调后上调再下调的趋势。Fernando等[13]研究发现，感染巴西野外分离株禽传染性支气管炎病毒(IBV/Brazil/PR05)可导致鸡的肾脏和气管中IL-6表达量显著升高，病变的发展状况与组织中存在的IL-6有关。因此，赵娜等[14]认为，鸡IL-6在替代抗生素，用作免疫增强剂和免疫佐剂等方面具有良好的发展前景。本实验研究结果表明，鸡柔嫩艾美尔球虫感染京海黄鸡后在盲肠诱发炎症反应，提高了IL-6基因表达量，增强了鸡球虫病的抵抗力。Bannerman等[15]研究表明，由大肠埃希菌感染引起的乳房炎的奶中，IL-8含量显著增加。张鑫宇等[16]对鸡马立克氏病病毒(CMDV)类白细胞介素8(vIL-8)基因进行了克隆和表达，发现vIL-8基因重组产物具有趋化鸡外周血淋巴细胞的活性。Min等[17]报道了IL-8在鸡艾美尔球虫DNA疫苗中佐剂应用。本研究发现，京海黄鸡IL-8基因在口服球虫卵囊后组织中的表达量与对照组差异显著，球虫卵囊感染的京海黄鸡的脾脏和盲肠组织中IL-8基因的表达量均升高，说明IL-8基因在鸡的球虫感染中发挥一定的作用。CCLi2是一类具有趋化能力的小分子蛋白，在肿瘤侵袭和转移以及单核细胞的募集、诱导和分化方面发挥重要作用，并在一些免疫相关疾病中活化免疫细胞，参与免疫调节[18-19]，还会促进骨髓中髓样细胞的活化[20-21]。本研究CCLi2基因在感染组脾脏和盲肠组织中的相对表达量较对照组均显著升高，说明CCLi2基因在京海黄鸡球虫病中发挥重要作用。

Baron等[22]在研究中发现，IL-8和IL-6基因协同表达升高有助于疾病的良好进展以及对病原体的抵抗。Kogut等[23]在鸡的沙门氏菌研究中发现，感染后鸡的IL-6和IL-8的mRNA表达显著上调，并且IL-6和IL-8的表达呈显著的正相关。CCLi2能够促进IL-4、IL-6等抗炎性细胞因子的大量分泌[24]，而在本实验中感染组和对照组脾脏和盲肠组织内CCLi2与IL-6基因也都存在极显著的正相关。Swaggerty等[25]通过连续3个世代选择外周血白细胞促炎性细胞因子白介素6(IL-6)、IL-8和趋化因子CCLi-2的高水平的肉鸡个体(非球虫感染)进行配种，发现3个基因的正向协同作用使其后代柔嫩艾美尔球虫的抵抗能力极显著地高于低水平选择交配群体，而且Swaggerty等[26]还发现，对沙门氏菌抵抗力较强的1日龄雏鸡体内IL-6和IL-8基因的表达量均高于易感鸡，且IL-6与IL-8基因的表达具有较强的正相关性。在本研究的感染组中，京海黄鸡脾脏中IL-6、IL-8和CCLi2之间均存在极显著的正相关，而在盲肠组织只有IL-6和IL-8、IL-6和CCLi2间存在极显著正相关；在对照组的脾脏组织中只有IL-8、IL-6基因与CCLi2基因之间存在极显著的正相关，而IL-6与IL-8基因之间相关不显著，在盲肠组织中IL-6、IL-8和CCLi2之间也均存在极显著的正相关。说明这3个基因对球虫病的发展具有协同作用。