陈 向，汪宝林，吴 琛，唐劲草，张 弛，褚朝顺

动脉灌注化疗栓塞术（TACE）是针对肝脏肿瘤的有效治疗方法，疗效确切，已经得到广泛的应用，但单纯TACE治疗的远期疗效并不理想[1～3]。肿瘤病灶内125I放射粒子植入是一种可以对病灶精确定位的新型放疗手段，能够有效提高局部病灶的放射剂量。目前，关于TACE联合放射粒子植入治疗原发性肝癌（PLC）患者的临床应用报道较多，且疗效肯定[4]。端粒重复序列结合因子（telomeric repeat binding factor 1/2，TRF1/2）是调节端粒结合蛋白，对维持端粒的正常结构和功能非常重要[5]，对于肿瘤细胞DNA复制、染色体运动和端粒长度的调节等生物学活动也具有重要的意义，与多种肿瘤的发生、病情进展和转移密切相关[6]。本研究探讨了TACE联合放射粒子植入术治疗的PLC患者肝组织TRF1和TRF2表达的变化，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年12月～2015年12月我院和南京医科大学第一附属医院接受治疗的PLC患者108例，男66例，女42例；年龄38～71岁。符合原发性肝癌诊断标准[7]。肿瘤形态为弥漫型18例，结节型40，块状型50例；Child A 级30例，B级66例，C级12例。纳入患者均未接受过任何放疗和化疗治疗，预计生存时间大于6个月，经影像学检查未发现其它部位转移。排除标准：（1）存在TACE治疗禁忌证；（2）血白细胞计数小于3.0×109/L、血小板计数小于80×109/L；（3）存在心血管系统疾病或肾功能损害者；⑷存在其他部位恶性肿瘤。采用掷硬币法将患者随机分为对照组54例和观察组54例，两组年龄、性别、肿瘤形态、Child分级等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究方案经我院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 在对照组，行TACE治疗，行局部麻醉后，经股动脉穿刺插入导管，造影确认肿瘤位置、大小、数目，明确相关供血动脉情况，缓慢注射吡柔比星（深圳万乐药业有限公司，国药准字H10930105）20～40 mg，奥沙利铂（江苏奥赛康药业股份有限公司,国药准字H20051985）50 mg和碘化油，取吡柔比星20 mg与48%碘化油10 ml比例混合，碘化油用量为10～15 ml。术后采取常规护肝治疗；在观察组，行放射粒子植入术联合TACE治疗，在TACE治疗1周后，将患者体位固定，行CT平扫，明确肿瘤大小、位置、癌旁组织结构，在体表标记。将CT扫描数据、125I治疗剂量和125I放射粒子活性等参数传输至计算机系统。采用Dany CT确定临床治疗靶区，并根据CT导航系统进行定位穿刺，确认针尖穿刺至治疗靶区后，通过针鞘将已确定剂量的125I放射粒子植入。再次行CT扫描复查，观察放射粒子分布情况，术毕，拔出穿刺针，对穿刺部位进行消毒、包扎。两组患者均实施3～4次TACE治疗，观察组仅进行1次放射粒子植入，治疗结束后随访12 m。

1.3 临床疗效评估 采用世界卫生组织关于实体肿瘤疗效的评定标准[8]评定疗效，即完全缓解（CR）：所有病灶消失；部分缓解（PR）：病灶体积减少至少50%；病情稳定（SD）：体内肿瘤病灶体积减少小于50%或增加不大于25%；进展或恶化（PD）：病灶体积增加至少25%或出现新的病灶。客观缓解率(RR)为CR和PR之和除以总例数（×100%）。

1.4 血清肿瘤标志物检测 采用ELISA法测定血清癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平，试剂盒购自联科生物科技有限公司。

1.5 肝癌组织TRF1和TRF2表达检测 分别于治疗前和治疗1月后行肝活检穿刺检查，获取肝组织，采用免疫组化染色（S-P）法检测。鼠抗人TRF1单克隆抗体和兔抗人TRF2单克隆抗体及其配套试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。由两名病理科医生阅片，遵循随机单盲原则，在400倍下避开切片边缘选取5处不重叠视野观察，计数TRF1和TRF2阳性细胞数。阳性判断标准[9]：细胞浆或细胞核内见棕黄色或棕色颗粒分布者，判定为阳性；阴性判断标准：胞浆内无棕黄色颗粒染色为阴性。采用半定量综合评分法对TRF1和TRF2的表达进行评估，评估标准：染色积分=染色强度分数×染色细胞百分比；细胞染色计分：0分为无染色细胞，1分为阳性细胞小于10%；2分为染色阳性细胞在11%～50%；3分为50%～75%，4分为超过75%的细胞染色阳性；染色强度：0分为无染色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。综合评分：0～2分为不表达，记为阴性；3～5分为弱表达，记为弱阳性；6～8分记为中等阳性；9～12分记为强阳性。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件对本研究数据进行统计分析,计数资料采用x2检验，计量资料以（±s）表示，采用 t检验。以 P＜0.05 被认为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效比较 在治疗后3 m，观察组客观缓解率显著高于对照组（x2=4.441，P＜0.05，表1）。患者男性，46岁。肝右叶见巨大占位，约13.3×16.1 cm，边界欠清，增强呈快进快出，内见坏死区，肝门部见多发稍大淋巴结；在介入治疗术后，肝右叶巨大占位较前缩小，最大截面约为10.1×13.3 cm，周围肝实质密度降低，病灶内可见斑片状致密影和少许气体样密度，增强后未见明显强化，肝门处和腹主动脉周围可见多发稍大淋巴结。

表1 两组近期疗效[(n)%]比较

2.2 两组血清CEA和AFP水平比较 在治疗3月时，观察组血清CEA和AFP水平显著低于对照组（P＜0.01，表2）。

表2 两组血清CEA和AFP水平(±s)比较

表2 两组血清CEA和AFP水平(±s)比较

与对照组比，①P＜0.05

例数 CEA(ng/ml) AFP(μg/L)对照组 治疗前 54 520.6±55.2 2420.2±290.3治疗后 54 312.5±33.9 1080.1±121.3观察组 治疗前 54 526.1±51.1 2371.4±245.2治疗后 54 273.7±38.1② 820.4±130.3②

2.3 两组治疗前后肝组织TRF1和TRF2表达的比较 观察组癌旁肝组织TRF1表达量为（9.7±2.3），显著高于癌组织的【（4.2±1.8），P＜0.01】，而观察组癌组织TRF2表达量为（9.2±2.2），显著高于癌旁肝组织的【（3.8±2.6），P＜0.01，图1～图3】。

图1 癌旁肝组织TRF1阳性表达在细胞浆中可见棕褐色颗粒（SP，400×）

图2 肝癌组织TRF1呈轻度阳性表达（SP，400×）

图3 肝癌组织TRF2阳性表达在细胞核和细胞浆中可见棕褐色颗粒（SP，400×）

2.4 两组生存率比较 观察组1 a生存率显著高于对照组 [96.3%（52/54）对 85.2%（46/54），x2=3.967，P=0.046]。

3 讨论

本研究采用TACE联合放射粒子植入术治疗PLC患者客观缓解率为79.6%，明显高于对照组的61.1%。分析认为肝动脉为肿瘤的主要供血动脉，TACE通过对肝动脉注入化疗药物，对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用，同时还能阻断病灶的供血，促进肿瘤凋亡[10]。放射粒子植入术能够精确定位肿瘤靶区域，局部大剂量放疗能够大大提高临床疗效。两者作用机制不同，联合使用能产生发挥协同作用，且经TACE治疗后能够有效改善肿瘤细胞对放疗的敏感性，进而提高临床治疗效果[11，12]。

研究发现，细胞端粒功能异常是导致细胞异变，继而引发癌症发生的重要原因[13，14]。端粒的结构和功能与细胞在增殖过程中DNA复制、细胞老化、细胞程序性死亡密切相关。恶性肿瘤细胞核内具有生物学活性较高的端粒酶，导致端粒的结构和功能异常，实现肿瘤细胞在一定程度上的持续性增长，是导致病情发生和恶化的重要因素。TRF1和TRF2是影响细胞端粒结构、活性和功能的重要蛋白。TRF1能够特异性调节结合DNA的端粒数量，从而对端粒长度实现负性调节作用，而TRF2的生物学功能是维持端粒结构稳定，保持端粒长度的动态平衡，影响细胞的增殖和凋亡。国外研究表明，恶性肿瘤组织TRF1的表达明显降低而TRF2较正常组织明显增高[15]。国外研究学者发现PLC患者TRF1和TRF2异常表达为PLC发病的独立危险因素，TRF1和TRF2表达水平与临床分期密切相关。他们认为对患者血TRF1和TRF2含量进行动态监测，对于疾病的诊断、病情及预后的评估具有重要意义[16]。Bouhlel L et al[17]指出，非小细胞肺癌患者血TRF2水平较健康对照人群明显增高。因此，探讨临床常用治疗方案对肝癌患者TRF1和TRF2表达的影响，对于临床治疗以及预后预测具有重要意义。采用TACE联合125I治疗能够明显调节患者肝组织TRF1和TRF2表达。原发病灶肿瘤边缘血管重建和肿瘤细胞增殖等活动中均有TRF1和TRF2的参与，进而影响肿瘤细胞增殖过程中的DNA复制。肝癌患者外周血TRF2呈异常增高，TRF1明显下降。肝动脉为肝肿瘤主要的血供来源，TACE将化疗药物直接灌注到相关肿瘤供血血管，阻断病灶血供，抑制血管增生，促进细胞凋亡，相关因子明显下降。TACE联合放射粒子植入术治疗患者病灶治疗区域局部放疗剂量较高，射线能直接破坏肿瘤细胞DNA双链结构，另一方面通过放射治疗使水分子电离生成自由基，对肿瘤细胞DNA同样具有杀伤作用，能够有效抑制肿瘤细胞的分裂、生长，能防止病情的恶化和转移，且对于病灶边缘区域内的残留组织供血，TACE无法直接阻断，而放疗则可以有效杀灭该区域的肿瘤细胞。此外，相关研究已经证实125I放射粒子植入能够改善肝癌患者机体免疫功能，增强自身防御机制[18]。两种方案联合治疗无交叉耐药，同时能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗的疗效，抑制肿瘤血管的新生，缩小病灶体积，改善患者的预后。