郭乐乐，张晓慧，张向颖，胡中杰，任 锋，张 晶

对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）和含有APAP的药物是最常用的解热镇痛药，临床上主要用于普通感冒或流行性感冒引起的发热，以缓解轻至中度疼痛[1]。Schegg et al[2]发现Colgalt2为介导胶原Glcαl和2Galβl-糖基化修饰的糖基转移酶，但其在急性肝损伤中的作用尚不清楚。本研究采用APAP制备急性化学性肝损伤动物模型，通过研究Clogalt2基因及其蛋白的表达，以进一步探讨APAP的致病机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 健康SPF级雄性C57BL/6小鼠100只，8～12 w龄，由北京军事医学科学院提供，在首都医科大学附属北京佑安医院动物中心饲养1 w，自由进食水。APAP购于美国Sigma公司，将APAP溶于无菌1×PBS中，配置浓度为25 mg/ml，55℃水浴锅加热至完全溶解，现配现用；Trizol裂解液购自美国Invitrogen公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq购自日本TAKARA公司；PCR引物购自上海生物化工有限公司；兔抗人GLT25D2多克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体和HRP标记的山羊抗兔 IgG均购自Cell Signaling公司；增强化学发光（ECL)试剂盒购自Santa Cruz公司。

1.2 急性肝损伤模型的制备 APAP浓度梯度模型的制备：取C57BL/6小鼠50只，随机分为对照组和100 mg·kg-1、250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP处理组。所有小鼠均禁食不禁水12 h。在对照组，给予1×PBS腹腔注射，在药物处理组，分别给予不同浓度的APAP腹腔注射，给药后继续禁食不禁水，8 h后急性肝损伤模型建模成功，收集血清和肝组织用于各项检测；APAP时间梯度模型制备：取C57BL/6小鼠50只，随机分为对照组、2 h、4 h、8 h和12 h APAP处理组，分别给予PBS 或者 APAP（25 mg/ml）500 mg·kg-1腹腔注射。给药后继续禁食不禁水，分别于相应时间点收集血清和肝组织，常规检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）；肝组织用于提取RNA、蛋白质，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察肝组织损伤情况。

1.3 肝组织糖基转移酶Colgalt2 mRNA相对水平检测 采用qRT-PCR法，使用 TRIzol试剂提取肝组织总 RNA，测定总RNA浓度并配制等量总RNA溶液。Colgalt2引物：正向引物gcaatgattgaccgtcctcc，反向引物 tccacagcctcgacaatctt。使用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA第一链，行实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系为20μl，热启动 95℃ 3 min；变性 95℃ 3 s、退火/延伸60℃延长 30 s，共 40个循环。应用 Biorad manager Systerm Software伯乐分析软件对PCR产物进行半定量分析，以次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）作为内参基因。采用实时定量PCR的Ct（cycle threshold）均值来表示，相对定量采用 2-△△Ct来计算[3]。重复实验至少3次。

1.4 肝组织Colgalt2蛋白表达检测 采用Western blot法，取小鼠肝组织约30 mg，立即置于预冷的组织裂解液0.5 ml中，冰浴下充分匀浆，然后于冰上静置 30 min，4℃下12000 g离心5 min，采用Bio-RadDc蛋白分析微孔板法测定上清液蛋白浓度。取肝组织50μg上样，电泳开始为80 v，当蛋白Marker电泳至分离胶后调为 120 v，使蛋白充分分离，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜（300 mA），加入一抗（1：1000稀释）4 ℃孵育过夜，加二抗（1：2000稀释）室温孵育1 h，1×TBST漂洗3次，取等量的增强化学发光试剂A液和B液混匀后，孵育聚偏氟乙烯膜，暗室压片曝光。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，多组样本均数的两两比较采用One-way ANOVA分析（对方差齐性者用LSD-t检验，对方差不齐者用Games-Howell法），P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清ALT和AST水平比较 见表1。在APAP浓度梯度模型，250 mg·kg-1APAP处理组动物血清ALT和AST水平显著升高（P＜0.05）；在APAP时间梯度模型，2 h APAP处理组动物血清ALT和AST水平显著升高（P＜0.05）。随APAP干预剂量的增加和时间的延长，小鼠肝损伤逐渐加重。

2.2 各组肝组织病理学表现变化 在APAP浓度梯度模型动物，100 mg·kg-1APAP处理组肝小叶轮廓清楚，部分肝细胞轻度水肿，未见明显坏死灶；在250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP处理组，随着APAP干预剂量的增大，肝小叶结构出现紊乱、肝细胞肿胀变性和坏死、炎症细胞浸润、出现片状坏死和桥接坏死（图1）。在APAP时间梯度模型动物，2 h APAP处理组可见肝小叶轮廓清楚，部分肝细胞轻度水肿及少量炎症细胞浸润；在4 h、8 h和12 h APAP处理组，肝小叶结构出现紊乱、肝细胞肿胀变性及坏死、大量炎症细胞浸润、大片状坏死和桥接坏死（图2）。

表1 各组血清ALT和AST水平（±s）比较

表1 各组血清ALT和AST水平（±s）比较

只 ALT（IU/L） AST（IU/L）对照组 10 28.6±5.3 130.7±24.0 APAP 100 mg·kg-1 10 33.6±4.1 144.6±17.3 250 mg·kg-1 10 1360.5±189.8 2147.1±133.4 500 mg·kg-1 10 3191.2±118.6 3628.8±107.9 1000 mg·kg-110 5022.7±234.6 5854.5±295.1对照组 10 26.7±4.6 107.8±24.0 APAP 2 h 10 80.7±8.0 247.1±23.9 4 h 10 694.1±63.5 857.5±69.2 8 h 10 1321.9±83.5 1658.5±109.5 12 h 10 3151.1±162.7 3395.2±620.6

图1 APAP浓度梯度模型动物肝组织病理学表现（HE，200×）

图2 APAP时间梯度模型动物肝组织病理学表现（HE，200×）

2.3 各组肝组织Colgalt2基因及其蛋白表达情况 见图3、图4。在 100 mg·kg-1和 250 mg·kg-1APAP 处理组肝组织Colgalt2基因水平显著低于对照组（P＜0.05），而在 500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP处理组，其水平显著升高（P＜0.05）；2 h、4 h、8 h 和12 h APAP处理组与对照组比，肝组织Colgalt2基因水平逐渐升高（P＜0.05）。在浓度梯度模型，100 mg·kg-1APAP处理组肝组织 Colgalt2蛋白表达稍强于对照组，250 mg·kg-1、500 mg·kg-1和 1000 mg·kg-1APAP处理组Colgalt2蛋白表达呈现明显增强趋势；在时间梯度模型，随APAP干预时间的延长，肝组织Colgalt2蛋白表达呈逐渐增强趋势。

图3 两种模型动物肝组织Colgalt2基因水平变化

图4 两种模型动物肝组织Colgalt2蛋白表达变化

3 讨论

APAP和含有APAP的药物是最常用的解热镇痛药[3，4]。研究发现，APAP是引起急性肝衰竭最主要的原因[5，6]。APAP和含有APAP的药物过量或者不恰当服用，会导致严重的肝损伤，成人服用APAP最大日剂量不超过4 g[7]，过量摄入将导致严重的肝损伤，甚至肝衰竭[8，9]。APAP毒性呈剂量依赖性，在特殊情况下如禁食时，细胞色素P450诱导的药物和酒精作用也会加重APAP引起的肝损伤[10]，可能原因是N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI）生成过多和谷胱甘肽（GSH）降低，NAPQI通过芳基化或使GSH等酶蛋白过氧化失活，生成自由基，对细胞产生损伤[11]，并且多余的NAPQI与胞内蛋白质结合形成复合物是线粒体氧化应激的最重要原因，同时也是肝细胞死亡最重要的起始事件[12]。

血清ALT和AST水平在一定程度上可以反映肝细胞损伤的程度[13]。本研究采用APAP诱导小鼠肝损伤模型，结果显示，动物血清ALT和AST水平随着干预时间和干预剂量的逐渐延长和增加而升高，肝组织学发生病理性改变，表明APAP可导致肝损伤，提示急性肝损伤模型制备成功。

蛋白质糖基化是真核细胞内分泌蛋白、膜锚定蛋白、糖脂及蛋白聚糖的常见的翻译后修饰过程，是指在肽链合成的同时或合成后，在酶的催化下糖链被接到肽链上的特定糖基化位点[14]。研究表明，蛋白质的糖基化修饰在肝病的不同发病阶段均发挥重要的作用[15]。蛋白质糖基化主要有N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化和GPI锚定连接四类[16，17]。O-连接的糖基化修饰是蛋白质最丰富的翻译后修饰[18，O-糖基化主要包括粘蛋白型O-聚糖，即O-连接的-N-乙酰半乳糖胺[19]、O-连接的-N-乙酰葡萄糖胺[20]和修饰胶原蛋白的O-糖基化修饰[21]。Colgalt2编码的跨膜蛋白胶原β（1-O）半乳糖基转移酶介导胶原分子上的羟基赖氨酸Glcαl和2Galβl-糖基化修饰[2]。为明确小鼠肝组织 Colgalt2与小鼠急性药物性肝损伤之间的关系，本研究对APAP时间-效应和剂量-效应进行了研究，结果发现随着APAP干预时间逐渐延长，肝脏损伤逐渐加重，Colgalt2基因及其蛋白水平上调。与对照相比，小剂量APAP组肝脏损伤不明显，Colgalt2基因表达下调，Colgalt2蛋白水平略有升高，而在大剂量APAP组肝脏损伤非常明显，Colgalt2基因及其蛋白水平显著上调。