糖基化修饰对乳清蛋白界面性质的影响

2019-01-22迟涛王玉堂王剑飞

中国乳品工业 2018年12期

迟涛，王玉堂，王剑飞

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院哈尔滨150028；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030）

0 引言

乳清蛋白是一种营养价值非常高的蛋白质、容易消化吸收、并且还含有多种人体需要的活性成分和必需氨基酸，因此人们对乳清蛋白的应用逐渐重视起来[1]。亲水性糖基的导入能够改善蛋白质的一些功能特性，例如乳化性、溶解性、抗氧化性等[2]。而连接的具有亲水特性的糖基分子是提高蛋白质的溶解性的主要原因[3]。研究报道，美拉德反应能够提高蛋白质的溶解性[4-7]。乳清分离蛋白与低甲基化果胶的美拉德反应产物，在pH 5.5时具有优良的乳化稳定性，这使乳清分离蛋白可用于酸性条件的应用[8]。Song等将壳寡糖导入酪蛋白和大豆分离蛋白的研究表明，糖基化的蛋白产物的表观粘度与未修饰蛋白相比有显著的提高，同时具有凝胶时间缩短，凝胶温度降低的特点[9]。Corzo-Martínez等人的研究表明，糖基化产物的表观黏度和弹性模量随着糖基化反应程度的增加而增加[10]。美拉德反应的产物会产生褐变，进而影响产品的感官特性，因为许多糖基化产物的褐变是人们不愿意看到的，并且糖基化产物的营养价值也会受到影响。此外，由于糖基化产物的结构比较复杂，种类繁多，美拉德反应所得到的糖基化产物在食品安全上也存在问题。

转谷氨酰胺酶是一种能催化酰基转移反应的酶，能够催化蛋白质分子中谷氨酰胺残基与赖氨酸残基中的ε-氨基发生反应，因此形成分子内和/或分子间赖氨酸异肽键，导致蛋白质分子发生交联反应，该反应以蛋白质多肽链中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基作为酰基供体，酰基受体为赖氨酸的ε-氨基。该反应能够使蛋白质在溶解性、起泡性、流变学性质等方面获得改善。与TGase催化蛋白质交联的研究相比，用TGase催化蛋白质的糖基化的研究比较少。由于糖基的导入使其蛋白质的重要的功能性质得到改善，基于酶法糖基化修饰蛋白质的良好的应用前景，以及这种修饰方法较强的可操控性，产物安全性的优势。本文拟采用乳清蛋白、氨基葡萄糖和壳寡糖为底物，利用TGase催化乳清蛋白与氨基葡萄糖、乳清蛋白与壳寡糖进行共价交联反应，将氨基葡萄糖和壳寡糖导入乳清蛋白分子，并探讨糖基化修饰乳清蛋白对其功能性的影响。目的为了确认TGase催化乳清蛋白糖基化的可行性，开发一种新的降低乳清蛋白的修饰方法，从而拓宽乳清蛋白在食品工业中的应用范围。

2 材料与方法

2.1 材料与设备

乳清蛋白（Brewster公司，美国）；氨基葡萄糖盐酸盐，转谷氨酰胺酶（江苏一鸣精细化工有限公司）；其它均为化学纯试剂。

旋转流变仪（Gemini II，英国马尔文公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 糖基化交联修饰乳清蛋白的制备

反应体系中乳清蛋白浓度50 g/L与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，TGase添加量为10 U/g乳清蛋白，pH为7.5，37°C恒温水浴震荡反应4 h。反应结束后，取出样品，置于85°C水浴锅中灭酶5 min，冷却。调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇8 000×g离心10 min，收集沉淀，乙醇洗两次。

2.2.2 游离氨基含量的测定

取一定体积的0.6 g/L标准亮氨酸溶液，稀释制得系列浓度的亮氨酸溶液（0、0.012、0.018、0.024、0.030、0.036 g/L），取稀释液3 m L，与同体积的OPA溶液混合反应5 min后，340 nm处测定溶液吸光度值。以亮氨酸浓度为横坐标，吸光度值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线。取其样品稀释液3 m L，按照上述步骤，测定其样品吸光度值。

2.2.3 乳化性的测定

用0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）溶解乳清蛋白样品。将样品溶液与大豆油混合（90∶30，V/V），在12 000 r/min条件下均质1 min。分别在0 min和静止10 min时取50μL乳液置于试管中，加入5 m L 1 g/L的SDS溶液混合均匀，在500 nm处下测定吸光度值。乳化活性指数（EAI）及乳化稳定性指数（ESI）为：

式中：A0——零时刻的吸光度值；C——蛋白质浓度（g/m L）；φ——油相体积分数（0.25）；A10——静置10 min后的吸光度值。

2.2.4 吸水性和吸油性

吸水性：离心管中加入0.5 g乳清蛋白样品，加入3 m L蒸馏水，匀速搅拌1 min，使蛋白样品与水充分接触，将离心管在室温下放置60 min，让蛋白样品充分吸水。然后5 000×g离心20 min，缓慢倒出上清液，称量离心管与沉淀的重量。持水性（WHC）按照下式计算：

式中：O0——加入蛋白质干重（g）；O1——离心管与干燥的蛋白质重量之和（g）；O2——离心管与离心后沉淀重量之和（g）。

2.2.5 流变性

配制p H=7.0的蛋白质分散液，乳清蛋白、交联交联乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化交联交联乳清蛋白和壳寡糖糖基化交联乳清蛋白的浓度分别为15%、15%、7%、7%。测定时，将样品分散液缓慢倾注充满夹具中（直径60 mm、锥角 0.5°的锥板），在25°C保温5 min。测定频率在0.1～10 s-1时测试样品的表观黏度。

配制pH=7.0的蛋白质分散液，乳清蛋白、交联交联乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化交联交联乳清蛋白和壳寡糖糖基化交联乳清蛋白的浓度分别为15%、15%、7%、7%的分散液缓慢倾注充满夹具中（直径60 mm、锥角0.5°的锥板），在25°C保温5 min。首先通过低振幅振荡测试确定样品分散液的线性黏弹区的应力振幅值（strain）。在剪切频率0.1～10 H z范围进行频率扫描试验，分析样品分散液的弹性模量（G′）和黏性模量（G″）随剪切频率的变化。

2.2.6 数据分析

本研究中所有数据均以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 16.0软件中的单因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan多重比较法进行数据统计分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。用Excel（2007）软件绘制图示。

式中：W0——加入蛋白质干重（g）；W1——离心管与干燥的蛋白质重量之和（g）；W2——离心管与离心后沉淀重量之和（g）。

吸油性：称取0.5 g蛋白质样品于离心管中，然后加入5 m L精制大豆油，匀速搅拌1 min，使蛋白样品充分与油接触，在室温下放置30 min后，5000×g离心20 min。将未吸附的油缓慢倒出，再进行称重。蛋白质的吸油性（OAC）按照下式计算：

3 结果与分析

3.1 游离氨基含量的变化

乳清蛋白修饰产物的游离氨基含量的变化如表1所示。氨基葡萄糖糖基化交联乳清蛋白的游离氨基含量（0.62 mol/kg蛋白质）和壳寡糖糖基化交联乳清蛋白的游离氨基含量（0.61 mol/kg蛋白质）明显低于乳清蛋白的游离氨基含量（0.70 m o l/kg蛋白质）和交联乳清蛋白的游离氨基含量（0.67 m o l/kg蛋白质）。氨基葡萄糖糖基化交联乳清蛋白的游离氨基含量与壳寡糖糖基化交联乳清蛋白的游离氨基含量在数据统计上没有显著差异（0.62 vs.0.61 m o l/kg蛋白质）。游离氨基含量的减少，主要是由于乳清蛋白的赖氨酸中的ε-氨基参与了蛋白质自身的交联。结果表明，转谷氨酰胺酶在催化氨基葡萄糖和壳寡糖导入乳清蛋白的过程中，同时乳清蛋白分子发生了自身的交联反应。反应体系中糖的变化对糖基化交联修饰程度并没有显著性的影响。

表1 乳清蛋白修饰产物游离氨基含量的变化

3.2 糖基化对修饰产物乳化性质的影响

利用比浊法对乳清蛋白、交联乳清蛋白以及糖基化交联乳清蛋白修饰产品的乳化活性和乳化稳定性进行了评价，其结果如图1所示，与原料乳清蛋白相比转谷氨酰胺酶催化的乳清蛋白修饰产物的乳化活性和乳化稳定性都下降，然而转谷氨酰胺酶催化的糖基化乳清蛋白的乳化活性和乳化稳定性下降的更多，并且下降的比例随着导入糖基分子的增大而增大。

图1 乳清蛋白及其修饰产物乳化活性及乳化稳定性

3.3 糖基化对修饰产物吸水吸油性的影响

乳清蛋白及其转谷氨酰胺酶催化的修饰产物的吸水性和吸油性的结果如表2所示。与原料乳清蛋白相比，交联乳清蛋白、氨基葡萄糖糖基化的乳清蛋白和壳寡糖乳清蛋白持水性分别提高了23.25%、24.25%和53%。在持油性方面，与原料乳清蛋白相比，交联乳清蛋白的持油性几乎不变，然而氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白和壳寡糖糖基化乳清蛋白的持油性分别提高了1.5倍和2.85倍。通过以上的数据结果可以表明转谷氨酰胺酶催化的糖基化交联修饰乳清蛋白能够显著的提高其持水和持油能力。然而也有一些研究结果表明，由于亲水性的糖基的导入能够提高蛋白质的持水能力同时持油性增加大豆蛋白糖基化交联修饰能够显著的提高大豆蛋白的持水能力，同时吸油能力也有所提高[11]，与本研究结果一致。

表2 乳清蛋白蛋白及其修饰产物的吸水性和吸油性

3.4 流变性

浓度分别为15%、15%、7%、7%的乳清蛋白、交联乳清蛋白、氨基葡萄糖修饰乳清蛋白、壳寡糖修饰乳清蛋白的0.1～10s-1剪切速率下的表观黏度曲线如图2所示。图2的数据表明，四种蛋白样品的表观黏度随着剪切速率的增加而逐渐降低，表现为非牛顿流体状态。四种蛋白样品的表观粘度的大小为：7%的壳寡糖糖基化的乳清蛋白〉7%的氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白〉15%的交联乳清蛋白〉15%的原料乳清蛋白。由此可见，壳寡糖糖基化的乳清蛋白的表观黏度必然为最大。上述的结果表明，转谷氨酰胺酶催化的乳清蛋白交联作用导致了蛋白质分子体积的增加，并且增加了蛋白质分散液的表观黏度，随着剪切速率逐渐增加，蛋白质分子的表观体积减小，交联乳清蛋白表现出剪切稀释特性。然而对于糖基化修饰的乳清蛋白而言，由于糖基具有很好的亲水性，所以糖基的导入增加了其表观黏度[12]，其表观黏度增加的大小与导入糖基分子的大小呈正比。研究表明，美拉德反应能够改变蛋白质的二级结构[13]，乳清分离蛋白与木糖、葡萄糖、果糖、乳糖等发生美拉德反应后，糖基化后的产物的无规则卷曲结构增加，并且无规则卷曲随着糖分子的增大而增加[14]。从而导致不同结构的糖基化产物界面性质的差异。

在0.1～10 Hz的频率范围内，测定了乳清蛋白(A)、交联乳清蛋白(B)、氨基葡萄糖糖基化乳清蛋白(C)、壳寡糖糖基化乳清蛋白的黏弹性(D)，其浓度与测定表观黏度的浓度一致，分别为15%、15%、7%、7%，四种分散液的弹性模量（G′）和黏性模量（G″）随剪切频率的变化如图3所示。

图2 乳清蛋白及其修饰产品分散液的表观黏度

图3 壳寡糖糖基化乳清蛋白及其修饰产物分散液的黏弹性变化曲线

从图3a可以看出，在0.1～1H z时乳清蛋白的分散液的黏性模量高于弹性模量，表现为液体特性，当频率在1～10Hz时分散液的弹性模量高于黏性模量，表现为固体特性。从图3 b、c和d中可以看出乳清蛋白修饰产物分散液的弹性模量均高于黏性模量，弹性模量占主导，表明各分散液明显显现出本身的固态性质。在0.1～10H z的频率范围内乳清蛋白修饰产物的黏性模量和弹性模量随着频率的增加而增加并且糖基化交联修饰的乳清蛋白的弹性模量和黏性模量均高于交联的乳清蛋白。壳寡糖糖基化乳清蛋白的弹性模量和黏性模量最高。通过流变学研究结果可以显示从乳清蛋白到交联乳清蛋白到修饰乳清蛋白，其分散液经历了从溶液到黏液的转变，表明转谷氨酰胺酶的催化修饰作用能够导致乳清蛋白产品内部结构上的差异。糖基化交联修饰导致乳清蛋白的黏弹性质发生了明显的改变。María Julia Spotti等人的通过美拉德反应的糖基化乳清蛋白的流变性的研究中也得到了相似的结论[15]。