张伟浩 柳贤德 朴伶华

摘要：将转基因斑马鱼Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）暴露于不同浓度的3种抗生素（盐酸庆大霉素、硫酸硫酸卡那霉素、盐酸万古霉素）中24 h，观察其荧光变化。结果表明，以ABIX野生型斑马鱼胚胎进行毒性试验，药物暴露24 h后盐酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素的最高合理浓度分别为120、150、240 μg/mL。3种抗生素对CYP1A转基因斑马鱼幼鱼药物暴露24 h后，盐酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和盐酸万古霉素分别在2、4、0.4 μg/mL时开始出现荧光。而与对照（0 μg/mL盐酸万古霉素）相比，Flk1转基因斑马鱼胚胎只有当240 μg/mL盐酸万古霉素的高浓度暴露下才会出现血管被显著抑制的效果（P<0.05）。综上所述，Flk1对这3种药物的敏感度过低，不适合用于这3种抗生素污染的检测，而CYP1A转基因斑马鱼幼鱼对这3种抗生素的敏感度都很高，可以作为这些抗生素污染的生物监测手段，这进一步开发了转基因斑马鱼在水环境检测氨基糖苷类和糖肽类抗生素污染中的应用。

关键词：抗生素;转基因斑马鱼;水质检测

中图分类号： X832  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）22-0269-04

近年来，在全球各地自然环境中频繁检测到抗生素，这些抗生素大多数为人用非处方药、兽用抗生素和饲料添加剂，其使用量大，持续时间持久，在环境中广泛存在，对于非靶标生物特别是水生生物的毒性作用逐渐受到重视。以我国为例，2013年全国36种常用抗生素总消耗量约为92 700 t，其中 54 000 t 抗生素经由人和动物排泄到体外，经过各种污水处理系统，最终53 800 t抗生素进入自然环境中[1]。畜牧业使用的抗生素绝大多数以原药被牲畜排泄物带进土壤后渗入地下水形成污染;水产养殖中使用的抗生素则有70%～80%最终会进入水环境[2]。目前使用较多的抗生素的种类主要有：β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、糖肽类抗生素、喹诺酮类等。

斑马鱼（zebrafish，Danio rario）具有个体小、发育周期短、养殖费用低、体外受精、透明、单次产卵数较高以及对污染物的反应快速等优点。更重要的是，斑马鱼的基因与人类基因相似度高达87%，并拥有与人相似的组织器官和系统，被国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）和经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）认定为标准鱼类毒性测试生物。水体受到污染物侵入后，鱼的生存环境发生转变，污染物通过鱼类鳃呼吸运动、吞食和鱼体表面渗入进入体内，继而鱼类的生理活动随着水体环境的污染程度做出反应[3-4]。其行为变化遵循环境压力模型，即随时间经历稳定、急剧变化、恢复、逐渐消失过程，行为强度会随污染物浓度和时间而变化[5-6]。相比于斑马鱼成鱼，早期生命阶段的斑马鱼胚胎因其快速、敏感、高通量和体外测试等优點被逐渐用于环境监测领域，成为环境监测的“哨兵”和“指示兵”[7]。

盐酸庆大霉素和硫酸卡那霉素同属氨基糖苷类化合物，作为廉价的广谱性抗菌素，在规模化养殖中使用广泛，近年来也有盐酸庆大霉素对鸡瘟治理效果很好的相关报道[8]。我国是氨基糖苷类抗生素的主要生产国，至2010年，盐酸庆大霉素产量突破2 500 t，其他如硫酸卡那霉素、奈替米星等的产量合计近1 000 t[9]。氨基糖苷类抗生素脂溶性差，因此人体和畜禽的胃肠道几乎不吸收，肌肉注射后大部分以原药经肾排泄[10]，因此在食物链中的富集情况非常严重。有研究认为氨基糖苷类抗性基因是在污水、废水和动物粪便中最频繁检出的一类抗性基因[11]，在天然水体中也有检出[12]，并且很多氨基糖苷类抗性基因与可移动遗传元件有关。然而氨基糖苷类抗生素及其抗性基因对环境影响的相关研究并不多。盐酸万古霉素属于糖肽类抗生素，其作用机制主要是通过阻碍细菌细胞壁的合成导致致病菌死亡，临床上主要用于治疗严重革兰氏阳性菌感染，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染[13]。因对革兰氏阳性菌有很强的抗菌效果，所以广泛用于家禽、家畜等饲料添加剂和兽药[14]。但这种药物的滥用导致耐药菌快速产生。据报道，2003年出现了大量耐盐酸万古霉素细菌[15]。因此，我国农业农村部规定将盐酸万古霉素列为禁用兽药。本试验选用这3种使用比较普遍的抗生素为对象，用生物监测手段观察转基因斑马鱼对不同浓度抗生素的反应，以期开发斑马鱼对于水质快速检测的潜力，使水质抗生素检测更经济快捷。

1 材料与方法

1.1 材料

试验药品：盐酸庆大霉素、硫酸卡那霉素、盐酸万古霉素（Biotopped，北京）。斑马鱼：ABIX野生型、Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）转基因型品系购自国家斑马鱼资源中心（CZRC）。仪器设备：斑马鱼养殖系统（爱生科技发展有限公司，北京）;BPC-250 F型生化培养箱（一恒科学仪器有限公司，上海）;X71荧光显微镜（奥林巴斯公司，日本）;一次性吸管、培养皿、塑料六孔细胞培养板（TrueLine，美国）;三卡因甲磺酸盐麻醉剂（简称TMS，CAS编号：886-86-2，Sigma-Aldrich公司，美国）;氯化钠、碳酸氢钠等化学药品均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司;Heal Force超纯水系统（力康集团，香港）。

1.2 3种抗生素的毒性试验

斑马鱼胚胎毒性试验：为保证对照组胚胎死亡率小于5%，排除未受精及异常胚胎对毒性评价的干扰，本试验选择在受精后48 h（48 hpf）开始暴露药物。收集到胚胎6 h后，去除异常和死胚，最后挑选出发育正常的胚胎。试验浓度范围根据预试验结果设置，将提前配制的高浓度储备液用蓝水稀释到不同梯度，包含1个对照组，5个处理组。每个处理组包含3个生物学重复，20个胚胎为1个重复。试验在6孔板中进行，每孔加入20个健康胚胎，尽量去除水分之后再分别加入不同浓度的处理液5 mL，对照组加入等体积蓝水。采用半静态方式进行暴露处理，将培养皿置于恒温生化培养箱中，暴露总时间为96 h（即从48 hpf～144 hpf），培养箱孵化温度为（28±0.5） ℃，处理液pH值维持在7，电导率约510 μS/cm，溶氧量>6 mg/L，胚胎保持光 —暗周期为14 h—10 h。毒性试验对斑马鱼胚胎每24 h更换1次处理液，及时挑出死亡的胚胎。每24 h对斑马鱼胚胎进行1次镜检观察，计量不同时期的各项生理指标和死亡、畸形等数据，进行记录。

1.3 抗生素对血管发育的影响

3种抗生素的不同浓度对48 hpf的Flk1斑马鱼胚胎暴露24 h，然后用荧光显微镜观察节间血管的直径。

1.4 抗生素对CYP1A蛋白表达的影响

在对CYP1A和Flk1的试验中，斑马鱼胚胎于48 h用灭过菌的镊子显微镜下手动破膜，并挑选出正常发育的幼鱼。3种抗生素的不同浓度对48 hpf的CYP1A斑马鱼胚胎暴露 24 h，然后用荧光显微镜观察荧光强度。

1.5 试验时间及地点

试验于2017年5月至2018年2月，在海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室进行。

1.6 数据统计

CYP1A斑马鱼胚胎观察其头部荧光强度，用软件Image J反转成灰度值分析出其荧光强度，最终以荧光强度值相互比较;Flk1斑马鱼胚胎观察其血管发育情况，选取中间部位的节间血管用Image-Pro plus分析出血管的直径，试验每组每个浓度胚胎数量至少20个。所有数据用SPSS分析，graphpad作图。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼胚胎毒性试验

2.1.1 盐酸盐酸庆大霉素对胚胎死亡率的影响 根据预试验结果，药物暴露96 h后，900 μg/mL浓度组幼鱼全部死亡，所以笔者选用900 μg/mL为盐酸庆大霉素的最高浓度。如图1-A，药物暴露24 h后盐酸庆大霉素的毒性开始显露，当盐酸庆大霉素为180 μg/mL时胚胎开始出现极少数死亡，死亡率只有2.5%。

2.1.2 硫酸硫酸卡那霉素对胚胎死亡率的影响 预试验结果表明，药物暴露96 h后，1 000 μg/mL浓度组幼鱼全部死亡，药物暴露24 h后从200 μg/mL开始出现死亡（图1-B）。

2.1.3 盐酸万古霉素对胚胎死亡率的影响 盐酸万古霉素不同浓度暴露96 h后，笔者发现当盐酸万古霉素浓度为 1 200 μg/mL 时幼鱼全部死亡，因此将1 000 μg/mL设为处理的最高浓度。药物暴露24 h后当盐酸万古霉素浓度为 300 μg/mL 时胚胎开始出现死亡，表明盐酸万古霉素的毒性发生点在200 μg/mL浓度持续处理24 h处（图1-C）。

2.2 抗生素对血管发育的影响

根据抗生素对胚胎处理24 h毒性的影响（图1），盐酸庆大霉素选用40、80、120 μg/mL浓度处理Flk1幼鱼;硫酸卡那霉素选用50、100、150 μg/mL浓度处理Flk1幼鱼;盐酸万古霉素选用80、160、240 μg/mL浓度处理幼鱼。盐酸庆大霉素和硫酸卡那霉素处理组的节间血管发育与对照（0 μg/mL）相比无显著差异，当盐酸万古霉素浓度为240 μg/mL处理时胚胎血管直径与对照出现显著差异（P<0.05）（圖2、图3），节间血管的直径减少至2 μm以下。

2.3 抗生素对CYP1A蛋白表达的影响

预试验表明，随着药物处理时间的延长，幼鱼最先出现绿色荧光的是脑部。由图4可知，药物暴露24 h后，这3种抗生素低浓度时可以促进CYP1A蛋白质的表达，并有浓度依赖性。由图4、图5可知，2 μg/mL盐酸庆大霉素处理组开始出现荧光，随着浓度增加各组间荧光强度逐渐增强并具有显著差异（P<0.05）;4 μg/mL硫酸卡那霉素处理组开始出现荧光，6 μg/mL处理组的荧光强度是4 μg/mL组的4倍，各组与对照组均具有显著差异（P<0.05）;其中，CYP1A蛋白对盐酸万古霉素的敏感性比盐酸庆大霉素和硫酸卡那霉素更强，在0.4 μg/mL处理组就开始出现荧光，相比于氨基糖苷类的盐酸庆大霉素和硫酸卡那霉素更敏感。

3 讨论

氨基糖苷类抗生素具有较强的肾毒性和耳毒性[16]，其滥用滥排现象已对人类和动物的生存环境构成威胁。盐酸万古霉素属糖肽类抗生素，起初因良好的耐药菌治疗效果在畜牧行业大量使用，因其滥用造成耐盐酸万古霉素菌快速形成。这些表明，环境中抗生素的污染不容小觑，因此，抗生素的早期检测是非常重要的。笔者希望转基因斑马鱼在作为现代医学模式动物“宠儿”的同时，也能在水环境监测中起到作用。

Flk1（EGFP）斑马鱼是针对血管发绿色荧光的转基因斑马鱼，Cross等运用G-RCFP标记插到VEGF2基因的启动子序列表达，从而得到了有绿色荧光血管的转基因斑马鱼，能很清楚地观察到血管的状态[17]。利用血管的可视化，可以快速准确地看出药物对血管的作用，本试验结果表明，盐酸庆大霉素和硫酸卡那霉素在一定浓度下对血管发育没有明显影响，而盐酸万古霉素在较高浓度时才有抑制血管生成的作用，这说明Flk1转基因斑马鱼不适用于这3种抗生素的快速检测。

CYP1A属于细胞色素P450超家族，广泛分布于脑、肝及其他很多部位中，参与烃类致癌物的代谢，CYP1A2在肝组织中有特异性表达，参与许多前致癌物和前毒物的代谢活化[18]。CYP1A转基因斑马鱼目前在水质检测方面较多应用于多环芳香烃类化合物的检测[19]，很少用于其他污染物的检测。Ohlsen等检测医院废水中的抗生素浓度，其中盐酸庆大霉素的浓度不低于0.01 mg/L[20]。本试验数据表明，盐酸庆大霉素和硫酸硫酸卡那霉素浓度分别为2 μg/mL和4 μg/mL时，CYP1A斑马鱼头部开始出现荧光。盐酸万古霉素浓度为0.4 μg/mL时，幼鱼头部开始出现荧光，这表明CYP1A对盐酸万古霉素更敏感。所以CYP1A具有作为氨基糖苷类化合物生物监测手段的潜力。

4 结论

随着基因工程技术的发展，转基因斑马鱼技术也越来越成熟。本试验得出，CYP1A斑马鱼在用于检测卤化芳香族碳氢化合物的同时，也可以作为其他部分化合物的生物标记。Flk1斑马鱼对这3种抗生素的敏感程度太低，所以不适合作为这3种抗生素的检测手段。这说明一种转基因斑马鱼在用于医学定向研究的同时可能还具有用于检测水体中化合物污染的作用，这进一步扩展了转基因斑马鱼的用途，为水体环境污染的快速监测提供了更经济方便的手段。

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