Klotho蛋白早期诊断严重创伤导致AKI的价值

2019-01-19杨银忠程文霞陈敏敏

国际检验医学杂志 2019年1期

杨银忠，程文霞，陈敏敏，赵鹃

(四川省人民医院东院检验科，四川成都 610101)

近年来，随着我国城市建设及社会的飞速发展，车祸伤、高坠伤、打击伤等创伤已严重威胁人类的生命安全，急性肾损伤(AKI)是严重创伤后临床常见的并发症。据统计，严重创伤后AKI发生率为30%～50%,且发病率呈逐年上升趋势，病死率可高达29%～90%[1-2]。传统的实验室检测肾损伤的指标主要有血肌酐(Scr)和尿量等，以估测肾损伤程度，但这些指标异常时患者肾实质有可能已发生不可逆转损伤。目前，早期诊断AKI尚不理想，因此，寻找快速、便捷、灵敏度和特异度高的生物学标志物对预测及早期诊断意义重大。Klotho 蛋白是体内Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，主要在肾小管上皮细胞中表达。有研究表明，在早期肾损伤时Klotho等基因表达改变，Klotho蛋白在血浆中水平较高，但在正常细胞及肾损伤修复后水平均较低，是反映AKI的一种理想标志物[3-4]。本研究通过观察严重创伤后AKI患者血清Klotho蛋白水平的动态变化，旨在探讨该血清标志物早期诊断AKI的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2017年3-12月该院重症监护室收治的严重创伤后1周内发生AKI患者43例作为AKI 组，其中男23例，女20例；平均(38.22±8.91)岁。车祸伤25例，高坠伤7例，挤压伤5例，刀刺伤3例，其他伤3例。排除既往有慢性肾脏病史、正在服用免疫类或糖皮质激素类药物和存在恶性肿瘤等基础疾病患者。选择年龄、性别、病因及手术方式与AKI组相匹配的40例创伤非AKI (NAKI)患者作为NAKI组，其中男21例，女19例；平均(38.23±8.01)岁。再随机选择健康对照组40例，其中男20例，女20例；平均(37.7±7.43)岁。各组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。所有诊断为AKI的病例均符合2005年急性肾损伤网络(AKIN)和2002急性透析质量倡议(ADQI)推荐的诊断标准：48 h内肾功能突然下降，血肌酐(Scr)绝对值增加≥26.4 μmol/L或达到基线值的1.5倍或尿量<0.5 mL/(kg·h)且持续超过6 h。本研究经医院伦理委员会批准，符合医学伦理要求。

1.2样本收集和指标测定

1.2.1样本收集收集患者术前(入院15 min内),术后2、4、6 h的血液样本各4 mL，4 000 r/min离心1 min取上清液进行检测。

1.2.2Klotho蛋白检测采用美国Cusabio公司生产的酶联免疫吸附测定试剂进行检测，严格按试剂盒说明书制定的操作规程进行操作，其实验原理为用纯化的抗体包被微孔制成固相载体，往包被抗Klotho蛋白抗体的微孔中依次加入标本和标准品、生物素化的抗Klotho蛋白抗体、HRP标记的亲和素等，经彻底洗涤后底物四甲基联苯胺(TMB)显色，颜色深浅与样本中Klotho蛋白量呈正相关，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样本浓度。

1.2.3Scr检测采用九强公司生产的肌氨酸氧化酶法试剂盒，采用美国Beckman-Coulter 5800全自动生化仪进行检测，严格按实验室操作规程进行操作。

2 结果

2.1各组研究对象Klotho蛋白水平比较 AKI组患者术前(入院15 min内)，术后2、4、6 h Klotho蛋白水平与NAKI组与健康对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；AKI患者术前(入院15 min内)Klotho蛋白水平升高，术后2、4、6 h逐渐下降。见表1。AKI组患者各时间点Scr水平比较及与NAKI组和健康对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组研究对象Klotho蛋白水平比较

注：-表示无数据

表2 AKI与和对照组Scr的检查水平及比较

注：-表示无数据

2.2Klotho蛋白的诊断效能 Klotho蛋白在术前(入院15 min内)，术后2、4、6 h的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.955、1.000、1.000、1.000，Klotho蛋白在术前(入院15 min内)，2、4、6 h的临床诊断临界点分别为0.122、0.165、0.144、0.101 ng/mL。见图1、表3。

图1 ROC曲线图

时间AUCSDP95%CI术前(入院15 min内)0.9550.0320.0000.892～1.000术后2 h1.0000.0000.0001.000～1.000术后4 h1.0000.0000.0001.000～1.000术后6 h1.0000.0000.0001.000～1.000

3 讨论

Klotho蛋白最初是在1997年由韩国科学家Kuroo在抗衰老研究中被发现的，其是体内Klotho基因编码的一种单向跨膜蛋白，主要表达在肾小管上皮细胞中，可在血液及尿液中检查到。近年来，HU等[5]研究表明，在AKI大鼠和小鼠中随肾功能损伤的进展，肾脏、血液和尿液中Klotho蛋白水平均显著减低，当肾功能恢复后体液和组织中Klotho蛋白水平又可恢复到正常水平。在研究AKI患者的尿液时也发现，Klotho蛋白水平显著减低，提示AKI是一种Klotho蛋白缺失的急性、暂时性病理状态[6]。同时，有研究表明，Klotho蛋白缺陷可加重缺血再灌注导致的组织损伤，而Klotho蛋白的过表达可缓解损伤，进一步证明Klotho蛋白表达变化在脏器缺血再灌注损伤的病理生理过程中具有重要作用，其有可能作为诊断AKI的一个新的标志物。目前，严重创伤后AKI相关Klotho蛋白指标的动态变化尚未见文献报道。

当患者发生严重创伤后肾脏是最易受累的器官之一，在创伤失血、脏器受损和休克等多种因素作用下，机体处于应激状态，直接导致肾脏血流量灌注不足或缺血，从而引起肾组织损伤，导致AKI的发生。有研究表明，创伤后发生AKI的原因与炎症介质过度活化和表达密切相关，在受损早期肾脏会及时自我维护及修复，包括早期阻止炎症细胞活化及炎症介质的释放等[7]。

目前，有研究表明，Klotho蛋白具有调节细胞表面多种糖蛋白的激素样因子功能，如上调热休克蛋白70表达等，提高抗凋亡蛋白稳定性和间接抑制氧化应激，通过抑制细胞内相关传导信号，上调抗氧化酶类的表达，在阻止早期炎症细胞活化和炎症介质释放方面具有一定作用[5-6]。因此，当机体发生严重创伤导致AKI后肾组织细胞凋亡导致Klotho蛋白表达下调，Klotho蛋白则作为一种激素样因子发挥抗凋亡、抗炎、抗氧化等作用，从而导致血液浓度发生相应改变。本研究通过比较AKI组、NAKI组和健康对照组研究对象血清Klotho蛋白发现，AKI组患者Klotho蛋白水平术前(入院15 min内)，术后2、4、6 h均明显高于NAKI组和健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但各组研究对象Scr水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明AKI患者术前(入院15 min内)及术后6 h内Klotho蛋白水平变化比Scr更早，对AKI的早期诊断价值明显优于Scr，与相关动物实验研究结果基本吻合[4-6]。

本研究在不同时间点AKI组患者Klotho蛋白检测结果比较发现，患者Klotho蛋白水平术前(入院15 min内)已升高，术后2、4、6 h逐渐下降，而术后6 h内Scr水平无多大变化，表明Klotho蛋白是预测严重创伤导致肾损伤早期诊断的良好指标，其次Klotho蛋白也可能与肾脏的修复具有一定关系[4]。但本研究与大鼠等动物实验研究结果具有一定差别[5-6]，大鼠实验组在创伤2 h后再逐渐降低，而本研究是AKI患者入院后就检测到升高再逐渐降低，可能是本研究所选择的AKI患者均为严重创伤患者和入院时间等因素有关。

目前，国内研究[4-8]和国外研究[9]探讨了在心脏术后引起急性缺血再灌注导致AKI时Klotho蛋白的变化，但尚未查阅到其他原因导致AKI时Klotho蛋白变化的文献。通过本研究和在心脏术后导致AKI的文献比较后发现，Klotho蛋白均有可能作为AKI标志物的价值，但本研究Klotho蛋白变化的时间比其他文献报道更早，可能与本研究AKI组患者创伤均较严重和就诊时间等有关。考虑到本研究仅为小样本单中心研究，故未来尚需多中心和多样本进行前瞻性研究，并评估其诊断价值。