王伟阳，李辉，刘涛，王翔，杨帆，解杰

华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤中心/急诊创伤外科，武汉 430030

骨肉瘤是临床常见的一种骨恶性肿瘤，从间质细胞系发展而来，肿瘤迅速生长是由于肿瘤是通过软骨阶段直接或间接形成肿瘤骨样组织和骨组织[1-2]。骨肉瘤患者早期出现血行转移，严重威胁着患者的健康与生命。因此，早期对骨肉瘤患者的病情及预后进行判断具有重要的临床意义。有研究发现，细胞正常凋亡受阻可能直接导致骨肉瘤的发生[3]。生存蛋白（livin）是一种新发现的凋亡抑制蛋白，存在于胚胎组织、胎盘和一些恶性肿瘤组织中，调控着胆固醇的平衡及类固醇的生成，对重塑激动蛋白细胞骨架和促进肿瘤细胞的迁移具有重要的作用[4-5]。肝受体同系物1（liver receptor homolog 1，LRH1，又称NR5A2）在胚胎发育早期参与肝和胰腺的分化[6]。Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，是反映恶性肿瘤细胞增殖情况的重要指标，其在其他肿瘤中表达情况的报道较多，但在骨肉瘤中表达情况的报道较少[7-8]。以上3种指标均与骨肉瘤的发生密切相关，但其具体意义仍需进行进一步深入研究。本研究通过观察livin、LRH1、Ki-67在骨肉瘤中的表达情况及对预后的评估作用，旨在为临床诊治骨肉瘤提供参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2015年2月至2017年2月华中科技大学同济医学院附属同济医院接受手术治疗且经手术病理证实的骨肉瘤患者的临床资料。纳入标准：①骨肉瘤的诊断标准参考文献[9]，均经病理学检查证实为骨肉瘤；②具有石蜡标本；③确诊后均接受手术联合化疗；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并原发性脑、心、肝、肾等器官功能障碍；③合并自身免疫性疾病；④既往有放化疗史和免疫治疗史。根据纳入和排除标准，本研究共纳入50例骨肉瘤患者，收集患者的骨肉瘤组织标本50例及相应的癌旁正常组织（距离肿瘤边缘5 cm）标本50例。50例骨肉瘤患者中，男28例，女22例；年龄7～48岁，平均年龄为（24.15±7.53）岁；肿瘤部位：股骨15例，肱骨10例，胫腓骨13例，其他部位12例；有软组织浸润32例，无软组织浸润18例。根据预后情况将组织标本分为死亡组（n=15）和生存组（n=35）。

1.2 主要试剂

鼠抗人Ki-67单克隆抗体购于迈新生物技术开发公司；兔抗人livin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，LRH1抗体购自TaKaRa公司，即用型采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptavidinperosidase，SP）免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 免疫组织化学染色

采用SP免疫组化法检测livin、LRH1、Ki-67的表达情况。将所有组织标本均采用4%甲醛溶液固定，并均经常规石蜡包埋后连续切片，切片厚度为4 μm，严格按照说明书的步骤进行，柠檬酸缓冲液煮沸修复，DAB显色，苏木素复染，将蛋白阳性切片作为阳性对照，将PBS液作为阴性对照，显色后进行脱水、透明、封片和镜检。在5个高倍视野（×400）显微镜下观察染色情况。

1.4 免疫组织化学染色结果判定

细胞中见棕黄色细小颗粒，可认定为livin、LRH1、Ki-67阳性染色，根据阳性细胞所占百分比进行评分[10]：0分为≤5%，1分为6%～25%，2分为26%～50%，3分为＞50%。根据染色强度进行评分：0分为不染色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。将阳性细胞所占百分比得分与细胞染色强度得分相乘，得出最终结果＞3分则判断表达阳性，≤3分则判断表达阴性。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。骨肉瘤患者死亡的影响因素分析采用Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织和癌旁正常组织中livin、LRH1、Ki-67阳性表达情况的比较

骨肉瘤组织中livin、LRH1、Ki-67的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两种组织中livin、LRH1、Ki-67阳性表达情况的比较[n（%）]

2.2 生存组、死亡组患者骨肉瘤组织中livin、LRH1、Ki-67阳性表达情况的比较

死亡组骨肉瘤组织中livin、LRH1、Ki-67的阳性表达率均高于生存组骨肉瘤组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 两组患者骨肉瘤组织中livin、LRH1、Ki-67阳性表达情况的比较[n（%）]

2.3 骨肉瘤患者死亡的影响因素分析

单因素分析结果显示：livin、LRH1、Ki-67的表达与骨肉瘤患者的死亡有关（P＜0.01）；多因素分析结果显示：livin、LRH1、Ki-67的表达是影响骨肉瘤患者死亡的独立影响因素。（表3）

表3 骨肉瘤患者死亡的影响因素分析

3 讨论

骨肉瘤是临床上常见的骨恶性肿瘤，多发于20岁以下的青少年，最常见的发病部位是股骨远端和胫骨近端，其发病机制目前尚不十分明确，临床表现为疼痛、肿块、跛行等症状[11-12]。其病程短且进展迅速，容易发生肺转移，肺转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。骨肉瘤细胞的转移是细胞与细胞外基质相互作用的过程，包括肿瘤细胞的异常增殖、细胞外基质成分的降解及肿瘤细胞的迁移等[13-14]。

livin是最新发现的人凋亡抑制蛋白家族中的一种蛋白因子，是凋亡抑制蛋白家族的重要成员，在细胞凋亡的基因调控中发挥重要的作用[15-16]。研究显示，livin在正常组织细胞中呈低表达，而在结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤细胞中呈高表达，参与了肿瘤细胞的异常增殖，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用[17]。在本研究中，骨肉瘤组织中livin的阳性表达率为62.0%，癌旁正常组织中livin的阳性表达率为18.0%，且死亡患者骨肉瘤组织中livin的阳性表达率高达93.3%，单因素分析结果显示，livin的表达与骨肉瘤患者死亡有关。张黎明[18]的研究结果也表明，骨肉瘤组织中livin的表达水平较高，可作为预测骨肉瘤的分子标志物。分析其原因是因为高表达的livin可能通过某种信号机制对恶变细胞的凋亡进程产生抑制作用，从而使肿瘤细胞产生免疫逃逸。

LRH1能够调控胆固醇的平衡及类固醇的生成，可通过对新型雌激素调节基因的调控，促进肿瘤细胞的增殖。诸多文献中提到，LRH1是一种癌基因，其参与了乳腺癌、胃癌和胰腺癌等多种肿瘤的发生、发展。LRH1通过激动细胞骨架的重塑和E-钙黏蛋白的分解能够促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移[19-20]。本研究结果表明，骨肉瘤的发生与LRH1的高表达有关，与上述研究结果一致。提示LRH1在骨肉瘤中呈高表达，在肿瘤的发生发展及转移中起到了促进作用。分析其原因是因为LRH1通过MMP9转录后失活促进上皮细胞向间质细胞的转化，而MMP9促进了肿瘤细胞沿溶解的基质部位向周围组织侵袭，是促进肿瘤细胞侵袭转移的关键酶。

Ki-67是标志增殖细胞核的一种核蛋白，能够很好地反映肿瘤细胞的增殖，其表达水平越高，表示预后越差；另外，其与细胞周期密切相关，是反映细胞增殖活性的客观指标[21-22]。本研究结果显示，Ki-67在骨肉瘤患者中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P＜0.01），提示Ki-67能够反映骨肉瘤细胞的增殖能力，在骨肉瘤的发生、发展、侵袭和转移中起着重要作用。分析其原因是因为Ki-67的过度表达缩短了骨肉瘤细胞的增殖周期，促进了骨肉瘤细胞的异常增殖。本研究结果还显示，livin、LRH1、Ki-67与骨肉瘤的预后密切相关，livin、LRH1、Ki-67是骨肉瘤患者预后不良的独立影响因素。

综上所述，在骨肉瘤组织中，livin、LRH1、Ki-67的阳性表达率均较高，三者共同参与着肿瘤的发生和发展，对于骨肉瘤诊断和预后评估具有一定的参考价值，值得临床深入研究与探讨。