王熠，童国强，计玉兵，付云杰

九江市第一人民医院呼吸内科，江西 九江 332000

在揭示非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的发生机制过程中，发现细胞因子的异常表达，可以影响肿瘤细胞的生物学特征，导致肺泡上皮细胞增殖、转录及凋亡调控过程异常，进而参与NSCLC的病情进展过程[1-2]。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、转录因子激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的表达水平升高，可以通过诱导肿瘤转录基因的激活，增加肿瘤细胞内核基因的激活程度，进而促进肿瘤细胞的持续性增殖[3]。Toll样受体 2（toll like receptor 2，TLR2）是识别脂多糖的特异性多肽类片段，通过影响炎性反应的激活，影响局部T淋巴细胞的免疫活性，进而干预肿瘤细胞的微环境，导致肿瘤细胞的增殖调控异常[4]。部分研究者探讨了NF-κB的表达与生殖系统恶性肿瘤的关系，发现NF-κB的表达水平在卵巢恶性肿瘤患者中明显升高[5]，但对TLR2的研究不多。为揭示NF-κB、AP-1、TLR2的表达与NSCLC的关系，本研究探讨了NF-κB、AP-1、TLR2的表达与NSCLC患者临床特征的关系，为临床NSCLC患者的病情评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2018年4月于九江市第一人民医院保存的80例NSCLC组织及其癌旁组织（距病灶边缘＞5 cm，且经病理证实为正常肺组织）。80例NSCLC患者中，男47例，女33例；年龄为42～71岁，中位年龄为60.5岁。纳入标准：①经病理学检查确诊为NSCLC；②术前未行放化疗等治疗；③临床资料保存完整。排除标准：①有其他原发性恶性肿瘤；②有免疫系统疾病；③病理组织切片制作差。

1.2 实验方法

石蜡包埋，连续性切片，厚度为3 mm，60℃烤片60 min。常规脱水后，采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）进行抗原修复，加入10 ml蒸馏水，加入10%过氧化氢5 ml，室温下孵育30 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤3次，每次3 min；加入NF-κB、AP-1、TLR2的单克隆抗体（1∶1000，购自罗氏公司），37℃孵育60 min，PBS洗涤3次，每次3 min；加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的 NF-κB、AP-1、TLR2蛋白二抗（1∶2000，购自罗氏公司），37℃孵育20 min，PBS洗涤3次，每次3 min；加入二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）后，PBS冲洗和复染，脱水后在显微镜下进行观察。

1.3 结果判断

NF-κB主要表达于细胞质或细胞核，AP-1主要表达于细胞核，TLR2主要表达于细胞质和（或）细胞膜，呈黄色颗粒沉淀。采用半定量积分法，每张切片随机选取5个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，对染色强度和阳性细胞比例进行评分。阳性细胞比例：0%为0分，＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分。染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色强度和阳性细胞比例得分相加后分数≥3分为阳性表达，＜3分为阴性表达。

1.4 观察指标

观察并比较NSCLC组织与癌旁组织中NF-κB、AP-1、TLR2的表达情况以及不同临床特征的NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2表达情况，分析NF-κB、AP-1、TLR2表达的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析数据。计数资料以例数和率（%）表示，采用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织与癌旁组织中NF-κB、AP-1、TLR2表达情况的比较

NSCLC组织中NF-κB、AP-1、TLR2的阳性表达率均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 NSCLC组织和癌旁组织中NF-κB、AP-1、TLR2表达情况的比较[n（%）]

2.2 不同临床特征的NSCLC患者NF-κB、AP-1、TLR2表达情况的比较

病理类型为腺癌的NSCLC患者的NF-κB阳性表达率明显高于病理类型为鳞癌的患者，差异有统计学意义（χ2=13.038，P＜0.01）；有淋巴结转移的NSCLC患者的AP-1阳性表达率明显高于无淋巴结转移的NSCLC患者，差异有统计学意义（χ2=14.165，P＜0.01）；中低分化的NSCLC患者的TLR2阳性表达率明显高于高分化的NSCLC患者，差异有统计学意义（χ2=13.382，P＜0.01）。不同性别、年龄、TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移的NSCLC患者的NF-κB阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同性别、年龄、病理类型、TNM分期及分化程度的NSCLC患者的AP-1阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同性别、年龄、病理类型、TNM分期及有无淋巴结转移的NSCLC患者的TLR2阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 相关性分析

NF-κB表达与AP-1、TLR2表达呈正相关（r=0.448、0.617，P＜0.05）；AP-1表达与TLR2表达呈正相关（r=0.504，P＜0.05）。

表2 不同临床特征的NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2的阳性表达情况

3 讨论

NSCLC的发生会增加肺癌患者短期病死风险，导致肺癌患者的总体生存时间缩短[6-8]。NSCLC患者治疗后的临床转归预后较差，但其病死率和多器官功能衰竭的发生风险无明显上升。越来越多的研究显示，基础生物学因子的改变，可以在促进NSCLC的临床病情进展的过程中发挥重要的作用。对NSCLC患者的病灶组织中NF-κB、AP-1、TLR2的表达分析研究，具有如下两方面的现实意义：①可以为临床上肺癌的血清学肿瘤标志物筛查提供新的参考指标；②可以为肺癌的综合性病情进展的评估提供依据。

NF-κB是核转录调控相关因子，可以提高肿瘤细胞的扩增速度，促进肿瘤基因的激活，进而增加肿瘤组织的增殖和浸润。此外，NF-κB的表达还可以影响肿瘤细胞内MAPK信号通路的激活程度，增加下游肿瘤细胞效应因子的转录水平，影响恶性肿瘤的发生[9]；AP-1是转录调控蛋白家族成员，可以影响肿瘤细胞转录调控蛋白的结合程度及肿瘤细胞周期，提高肿瘤细胞S/G0期的比值；TLR2是识别脂多糖的免疫调控因子，可干扰局部肿瘤微环境，导致肿瘤细胞生物学特征显著改变，加剧肿瘤的发生发展[10]。关于NF-κB、AP-1的表达与肺癌发生发展的研究显示，NF-κB、AP-1的表达水平与肺癌移植瘤的凋亡密切相关[11]，但缺乏对TLR2的表达与肺癌患者临床特征关系的分析。

本研究通过免疫组化方式探讨了NF-κB、AP-1、TLR2的表达情况，发现在NSCLC组织中NF-κB、AP-1、TLR2的阳性表达率均明显高于癌旁组织（P＜0.01），提示 NF-κB、AP-1、TLR2的表达均会影响NSCLC的发生过程。这主要与NF-κB、AP-1、TLR2的下列两个方面的作用途径有关：①NF-κB、AP-1表达水平升高，不仅可以提高肿瘤细胞转录上游启动子的激活程度，还可以影响肿瘤细胞跨越G0期的速度；②TLR2对T淋巴细胞抗原提呈细胞的抑制作用，可以影响到T淋巴细胞的免疫逃逸过程，导致肿瘤的扩散和浸润[12-14]。研究显示，NF-κB在正常肺组织中的阳性表达率为15.0%，而在NSCLC组织中的阳性表达率上升至75.8%[15]，说明在具有明显的肿瘤高负荷或者多器官功能障碍的肺癌患者中，NF-κB的上升程度更显著。在探讨相关细胞因子的表达与NSCLC患者临床特征的关系过程中发现，肺腺癌患者的NF-κB阳性表达率较高，提示NF-κB的表达波动可能影响肿瘤细胞的发生来源，这可能由于肺腺癌患者的肿瘤细胞持续自我分泌功能的亢进，提高了NF-κB的释放速度；有淋巴结转移患者的AP-1阳性表达率明显上升，这主要是由于AP-1的表达水平升高可以提高肿瘤细胞对淋巴结组织内皮细胞的黏附能力；肿瘤细胞分化程度较差或者中低分化患者的TLR2阳性表达率明显升高，提示TLR2的表达与肺癌患者的临床特征密切相关，TLR2表达水平升高可以导致肺癌上皮细胞的分化成熟障碍[12-15]。NF-κB、AP-1、TLR2的表达具有一定的内在关系。

NSCLC患者的NF-κB、AP-1、TLR2的阳性表达率明显升高，同时NF-κB、AP-1、TLR2的表达与肺癌患者的临床特征密切相关，但NF-κB、AP-1、TLR2在诊断NSCLC临床预后过程中的作用仍然需要进一步的探讨。