王晓东，刘爱峰，金鸿宾，李容

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）以关节软骨退行性改变为核心，其主要改变是关节软骨细胞外基质环境变化，而软骨细胞的改变也同样起着关键的作用。因此，软骨的病变是引起膝骨性关节炎（osteoarthritis of knee，KOA）重要的病理基础之一，但是对于KOA患者，常规治疗往往只能缓解症状，延缓发展，却不能很好地恢复关节以往的功能，这是因为破损的软骨自身很难再生修复，即便通过一些手段在结构上可以恢复，但功能却不能得到保留。近年来，软骨组织工程技术的发展为解决这一难题提供了一条新的途径。当前，组织工程技术主要把干细胞的分化应用作为研究重点，并且已经在多个临床学科开始应用，特别是在一些疑难重症的治疗上取得了非常好的效果［1-2］。

间充质干细胞（MSC）作为成体干细胞的一员，具有很强的自我复制与横向分化潜能，是多种细胞的前体细胞，此外，MSC还具有低免疫原性及对损伤组织有趋向化的特点。这些优势使MSC成为软骨损伤修复的理想种子细胞［3］，目前越来越多的研究证明，将该类细胞与其他材料联用可以发挥出更佳的治疗效果。石墨烯是一种新兴碳材料，能促进干细胞增殖及向软骨分化，具有抗菌性和载药缓释性，在生物组织工程等医学领域的应用受到人们的广泛关注［4］。因此，基于KOA的病理特点、MSC对软骨的修复能力以及石墨烯支架立体培养的优势，将三者结合起来可以为治疗KOA软骨损伤提供一种新的启示。

1 KOA软骨损伤机制研究

目前，比较公认的KOA的发生机制是关节软骨合成和降解的正常偶联作用失衡。因此，KOA的病理核心在于软骨细胞，诸多因素可对软骨细胞产生影响甚至破坏，最终导致疾病的发生。

膝骨关节组织内的相关细胞因子是维持软骨细胞以及膝关节内环境稳态的基本要素。一些学者通过测量膝关节软骨以及关节液中白细胞介素（interleukin，IL）的含量发现，软骨下炎症面积同关节液中IL-1的含量呈正相关，即膝关节液中IL-1含量随着软骨下炎症面积的增大而升高［5］。IL-1β由局部参与炎症反应的单核细胞和巨噬细胞产生，通过刺激基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）来调节免疫反应及其下游的反应，降解软骨［6］。

在KOA的病理过程中，滑膜细胞与软骨细胞均会受累，两者可分泌过多的MMPs，同时在各种因素的干预下，关节软骨中的细胞外基质成分发生游离，软骨细胞的抗应力能力逐渐减弱直至凋亡，从而导致了软骨破坏的发生［7］。另有研究发现，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α同样参与关节软骨中MMPs的表达，TNF-α来源于巨噬细胞，是关节软骨降解时重要的促炎症细胞因子，TNF-α血清表达水平与KOA病情严重程度呈正相关［8］。

此外，近年来人们对KOA的关注开始聚焦到基因层面。Yamasaki等［9］发现IL-1β可以造成KOA患者的关节软骨中miR-146a基因的表达减少，进而加速关节软骨的降解过程，导致其正常生理功能的破坏。目前研究多认为，KOA的病理是由关节内生化与力学环境的稳定被破坏，而软骨的破坏是KOA发生的核心过程，如果想彻底治疗KOA甚至逆转其病理过程，那就离不开关节内软骨细胞的全面修复或是再生。

2 软骨组织工程中MSC的应用

软骨组织缺乏血管提供的营养供应，因此在其损伤后很难再生修复。目前针对软骨缺损再生修复治疗更多的是使用软骨细胞自体移植［10］。MSC具有强大的增殖能力和多向分化潜能以及免疫重建功能，且其来源方便、易于培养、具有低免疫原性等。

2.1 MSC软骨分化 MSC最初在骨髓组织中被发现，目前脐带、胎盘、脂肪、滑膜等组织同样被发现亦是其合适的来源，而且均具有多向分化潜力，并具有特定细胞因子的分泌功能。Zhang等［11］发现当Sox9因子联合骨形态发生蛋白2（BMP2）培养骨髓间充质干细胞（BMSC）时，可促进BMP2诱导的基因（Col2a1、Col10a1）mRNA表达上调，进而提高体外培养的BMSC的软骨分化能力。Sasaki等［12］研究表明，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可以促进并诱导BMSC的体外增殖并向软骨分化，并以此对受损软骨进行修复。目前，研究多认为以BMSC的分化潜能最强［13］，但年龄因素、增殖分化能力减退因素以及取材时的损伤等会限制BMSC的广泛应用。Yoshimura 等［14］通过对比滑膜间充质干细胞（synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSC）与BMSC传代后的差异发现，SMSC集落形成率、倍增速率和生长动力学高于BMSC，并且可产生更多的软骨基质，形成更好的软骨颗粒，说明SMSC具有更强的成软骨分化能力。此外，SMSC分化的软骨组织具有很强的浅区蛋白合成分泌作用，可减少关节面摩擦力，对于修复关节软骨组织损伤有较好的效果［15］。

2.2 MSC治疗膝软骨损伤的应用 膝关节软骨损伤是造成KOA最为关键的一环。Zhang等［16］研究发现，MSC外泌体在介导软骨修复的过程中主要是以提高细胞增殖并减少细胞凋亡为主要特征，并且这一重塑特征是动态的，随着时间推移，细胞的增殖呈逐步加速状态，细胞凋亡也逐步减少，这有利于软骨的加速修复。同时，经外泌体处理的骨缺损处再生的软骨也表现出一个再生的免疫表型，其特征是CD163+再生M2巨噬细胞浸润多于CD86+M1型巨噬细胞，且伴随着促炎症滑膜细胞因子IL-1和TNF-α的相应减少，即增加M2巨噬细胞浸润的同时减少了M1巨噬细胞和炎性细胞因子。临床中通常将自体收集培养的BMSC进行体外增殖、传代培养，并将其注射至KOA患者的关节腔内进行膝软骨损伤治疗，治疗后患者的膝关节活动功能明显改善、疼痛减轻。研究显示，MSC治疗轻中度OA有一定疗效，关节腔内培养的MSC可通过对炎症的抑制及逆转软骨降解等途径发挥作用［17-18］。

2.3 MSC联合支架材料修复软骨损伤 对于膝关节软骨损伤，无论以细胞还是生长因子为基础来进行组织工程软骨的修复与重建，在软骨缺损区域植入支架进行搭载均是必要的。利用支架系统植入MSC，可在缺损空间内进行有序的三维立体增殖培养［19］。利用MSC的生物调节作用所分泌的生物活性因子，可促进软骨周围组织细胞的增殖分化，为软骨缺损的修复提供所需要的稳态环境［20］；同时支架结构的仿生表面的取向作用也有利于引导种子细胞的定向分布，可重新分布新生组织的力学平衡，促进软骨在形态和功能上的恢复。可以说，支架材料是软骨组织工程应用的桥梁，基于该种方法，MSC的使用就多了联合多种支架材料搭载的新途径。Sawatjui等［21］制备了丝素蛋白（SF）与透明质酸盐（SF-GCH）联合使用支架，并以BMSC接种，以评估动态压力载荷条件下联合支架结构的性能，结果显示在动态压力下BMSC有更高的糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）和胶原蛋白表达能力，说明动态压力载荷条件下提供的软骨周围微环境增强了软骨细胞的生物合成和基质积累，提示不同力学环境对支架联合体系的软骨组织修复力也可产生不同影响。因此，支架搭载MSC可更加准确、强效地修复软骨缺损区域，同时还可对软骨周围基质力学与生化稳态环境产生影响，创造有利于软骨修复的条件。

3 石墨烯材料搭载MSC的应用

石墨烯是近年来广受关注的一种新型纳米材料，低浓度和小尺寸的纳米级石墨烯材料如氧化石墨烯（GO）等具有较好的生物相容性及安全性［22］。目前，三维石墨烯支架结构已经被证实具有促进MSC分化的能力，且不影响细胞的增殖作用［23］。魏丽君等［24］将氧化石墨烯与低聚乙二醇富马酸酯水凝胶混合，并作为培养基质包裹BMSC以诱导其向成骨分化，与单纯低聚乙二醇富马酸酯水凝胶相比，加入氧化石墨烯能更好地促进BMSC向成骨细胞分化，表明其具有更好的生物相容性，是一种良好的骨组织工程支架材料。因此，MSC可借助石墨烯材料纳米级结构网立体分布并培养在软骨缺损区域，促进干细胞更好地修复软骨缺损，恢复软骨基质外部稳态环境，进而改善KOA的病理状态。研究认为，应用石墨烯纳米支架作为三维培养基质稳定可靠，基于石墨烯纳米支架三维培养MSC还可调节关节微环境，且既可改变膝关节力学微环境也可改善膝关节生化微环境［25］。

基于这些因素，石墨烯材料也有望搭载MSC应用到软骨组织工程中，近年来的一些基础研究也证实了这一方法的可行性。Shen等［26］将氧化石墨烯纳米片和BMSC装入聚乙二醇（PDLLA）水凝胶中，并在没有补充软骨诱导因子的情况下评估了BMSC在石墨烯纳米材料中沿着软骨细胞谱系的分化情况：在氧化石墨烯混合水凝胶中培养的BMSC维持了高细胞存活率，表明氧化石墨烯的细胞毒性很小，另外，GO/PDLLA内的BMSC的软骨基质基因和Ⅱ型胶原基因表达水平均有显著提高，产生了更多的软骨基质，且随着GO浓度的增加，向软骨细胞分化的作用亦增强。Zhou等［27］利用生物油墨3D技术打印出有层次结构的GO凝胶基支架，并让BMSC在该三维有序支架上进行增殖，并向软骨分化，结果同样证实了GO支架结构对诱导BMSC软骨分化有促进作用，分化后的糖胺聚糖和胶原水平有明显升高。此外，人工制造定制的GO支架具有特殊有序的组织矩阵与层次结构，利用该特点能够极大地提升蛋白的吸附亲和力，这样可以使那些具有促进软骨修复作用的基质蛋白沉积在支架表面，这有利于分化的软骨细胞增殖和存活，并且培养的MSC在人工GO三维支架上的增殖分化能力越强，这一优势就更明显［28］。因此，使用石墨烯支架材料，即使在不使用外源性生长因子的情况下，也可以提供MSC向软骨细胞分化所需的生化及力学微环境的稳定，从而为治疗KOA提供一个稳定的关节内环境。

石墨烯材料能够提供软骨细胞生长所需的支架载体，而石墨烯支架还具有将关节内的载荷压力分散转移到周围的骨骼和软组织中的特点，原因是石墨烯具有较大的表面积，可使载荷在复合结构中有效地传递开来。另一方面，石墨烯材料本身具有优异的阻尼特性以及光滑的表面结构，可以在膝关节腔中充当一种固体颗粒润滑剂使用，而软骨的磨损是导致KOA的重要原因，KOA软骨表面应力特征也表明软骨的修复需要受力微环境的稳定，因力学环境的较大变化可引起软骨下界面的开裂，进而影响缺损软骨的修复过程［29-30］。因此，利用石墨烯材料既可充当MSC培养的支架材料结构，还可起到对关节腔的润滑作用，减小软骨面受到的摩擦力，为软骨的再生修复提供稳定的力学环境［31］。最后，利用石墨烯材料搭载MSC培养可使支架细胞复合结构与关节软骨充分接触，填充关节缺损区域，修复软骨及软骨基质，相对于传统MSC治疗方法其在润滑环境与接触面积上均有很大的优势，可将其看作是在膝关节封闭的关节腔内起到类似关节液的作用的一种复合结构，一种具有可搭载向软骨分化能力的MSC的固体润滑颗粒材料。

不过，目前利用石墨烯支架搭载MSC对KOA软骨损伤模型的试验研究还处于起步阶段，无论是石墨烯材料的生物工程应用还是MSC的软骨组织工程均是当前研究的热门领域，相信二者的结合在早期的KOA治疗中会取得真正意义上的效果。

4 结语与展望

KOA是中老年人的常见病，而且随年龄增长呈进行性加重的趋势，虽然当前中西医的临床治疗方法众多，但均不能从根本上解除疾病的核心问题，即关节软骨的退变损伤，更不能逆转其病理过程。MSC具有软骨分化能力及炎性损伤的修复能力，但是距离恢复软骨整体功能、延缓甚至逆转膝OA的病理过程还有很大距离。同样，近些年来石墨烯材料在医学领域受到广泛关注，但多作为外科置换材料使用，且国内外的基础研究较少，应用到KOA的软骨组织工程研究中的更是稀少。不过石墨烯材料如氧化石墨烯等具有多层次、小颗粒的优点，是理想的支架材料之一。传统医学认为，人与外界环境具有统一性，而软骨与其外部的力学及生化环境同样有相互联系，这种联动的稳态是软骨真正意义上再生修复的重要条件，应当内外兼顾。因此，若将间充质干细胞搭载到氧化石墨烯纳米级结构中，必然可以起到优势叠加的效果。