颜思璐，高颖博，冯海嫦

(1.广州市白云区妇幼保健院新生儿科；2.广州市白云区妇幼保健院产科，广东 广州 510410)

胎膜早破是妊娠期常见的并发症之一，主要是指临产前胎膜破裂，研究发现感染是导致胎膜早破的主要原因之一[1]。胎膜破裂后，其屏障保护作用消失，但此时新生儿的免疫功能尚未发育完善，容易被各种病原体侵入体内，进而引发感染，这是导致胎膜早破新生儿死亡的主要原因之一，可能引起早产及母婴围生期感染等严重的并发症，危及母婴安全，因此早期准确诊断新生儿宫内感染是我们医生工作的一大重点[2]。本文旨在通过测定胎膜早破并有绒毛膜羊膜炎的孕母的外周血Toll样受体和新生儿的Toll样受体，探究其与新生儿宫内感染的关联性，从而通过母亲的阳性指标用于指导新生儿宫内感染的早期诊断及临床治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据以下纳入排除标准选取我院2015年1月至2018年1月于产科住院足月胎膜早破的单胎初产妇120例，分娩后的新生儿均按高危儿转新生儿科。产后胎盘胎膜常规送病理检验，根据病理检查结果有无绒毛膜羊膜炎将孕母分为感染组和非感染组，其中感染组有68例，非感染组有52例。

纳入标准：(1)年龄≥18 周岁；(2)首次妊娠者；(3)单胎；(4)足月胎膜早破(妊娠37周以后发生的胎膜早破)并未使用抗生素者或使用抗生素前；(5)无严重的出凝血功能障碍者；(6)符合第7版《妇产科学》中胎膜早破的诊断标准[3]：①阴道宫颈消毒后，在窥器直视下按压宫底见羊水流出者；②拭去宫颈口处黏液及血液，宫颈流出液测pH>7；③阴道后穹窿液涂片见羊齿植物叶状结晶；④羊膜镜检查可以直视胎先露部，未见前羊膜囊。

排除标准：排除合并有胎儿生长受限、妊娠期糖尿病、妊娠期高血压疾病、心血管系统疾病、内分泌系统疾病、肝病、风湿性疾病活动期等其他系统感染等合并症及并发症者、未足月胎膜早破者、双胎及多胎胎膜早破者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 母血采集：自然分娩的孕妇在活跃期内、剖宫产的孕妇在术前30 min，抽取肘静脉血5 mL，并且立即注入EDTA抗凝管中，混匀后4 ℃保存，送金域检验中心，采用Trizol一步法提取总RNA，逆转录成CDNA，采用流式细胞仪(美国BD公司)RT-PCR法检测TLR-2和 TLR-4mRNA。

新生儿血采集：所有新生儿均于24 h内采集血7 mL，5 mL送检验科进行血常规、PCT、CRP及血培养检测，试剂盒为48孔配置，6孔用于阴阳对照，空白和质控。另外周血2 mL送金域检验中心，方法同上述，检测TLR-2 mRNA和 TLR-4 mRNA。

1.2.2 标本处理 制备血清：所有血液标本乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，Ficoll (P：1.077)密度梯度离心法分离PBMC备用(室温下，3 000 r/min离心20 min)。参照TRIZOL[GLBCOBRL公司]的一步法提取总RNA，然后应用RT-PCR仪器进行CDNA逆转录。

TLR2-mRNA和TLR4-mRNA检测方法；由上海生物工程有限公司合成引物设计，采用SYBER green I 和ABI 7000PCR仪进行荧光定量PCR，采用荧光定量法，制作标准曲线。

血常规、PCT、CRP检测：采血当日进行检测，CRP检测采用免疫比浊法，PCT检测采用双抗体夹心法。

血培养：胎儿一经娩出，在使用抗生素前即采静脉血2 mL，注入细菌培养基。

胎盘胎膜常规送病理检验：胎盘娩出后，分别取大小约2 cm×2 cm 胎盘和胎膜组织，取后立即置于10%甲醛溶液中固定，立即送病理检查。经过专人采用HE染色的双盲法阅片，绒毛膜羊膜炎的诊断标准为电镜下每高倍视野胎膜或胎盘任何一处的中性粒细胞浸润大于11个[4]。

1.2.3 实验方法 孕母均于临产前行外周血检测 TLR-2 和TLR-4mRNA 定量检测，生产后胎盘胎膜常规送病理检查根据结果是否诊断绒毛膜羊膜炎回顾将孕母及其新生儿分为感染组和非感染组。所生的新生儿均按高危儿转新生儿科，并分别于第 1、7 天行外周血 TLR-2 mRNA 和 TLR-4mRNA 定量检测，PCT、CRP浓度检测，血培养，并临床观察呼吸道、消化道、泌尿道等有无感染的临床表现。新生儿感染主要包括了败血症、肺炎、坏死性小肠结肠炎等，感染具体的诊断标准参照第四版《实用新生儿学》[5]。记录并收集数据，进一步分析母亲与患儿之间Toll样受体水平及新生儿出生后感染的临床表现有无相关性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，统计检验采用方差分析，分类变量采用χ2检验，采用Spearman相关分析方法进行相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的一般情况比较 感染组和非感染组的产妇均来自本院住院分娩且年龄、孕周相近的初产妇，两组孕妇年龄及孕周均差异无统计学意义(P>0.05)，两组入选孕母具有可比性，见表1。

2.2 感染组与非感染组新生儿之间比较情况 感染组与非感染组新生儿之间相比较，感染组的新生儿的白细胞水平、CRP 、PCT水平均较非感染组明显升高(P<0.05)，差异存在统计学意义。感染组新生儿血培养阳性率及新生儿存在感染表现的阳性率均明显比非感染组新生儿升高(P<0.05)，差异存在统计学意义。提示胎盘胎膜病理结果诊断绒毛膜羊膜炎的新生儿绝大多数临床上同时提示感染，见表2。

表1 两组孕妇年龄和孕周相比较情况

表2 感染组与非感染组新生儿之间相比较情况

2.3 感染组与非感染组新生儿之间 Toll 样受体水平比较情况

感染组与非感染组新生儿之间 Toll 样受体水平相比较，感染组新生儿的TLR-2mRNA及TLR-4mRNA水平在第1天及第7天时均较非感染组明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。提示新生儿 Toll 样受体水平升高与新生儿宫内感染密切相关，见表3。

表3 感染组与非感染组新生儿之间Toll样受体水平相比较情况

2.4 感染组与非感染组孕母之间 Toll 样受体水平比较情况 感染组与非感染组孕母之间 Toll 样受体水平比较，感染组孕母的Toll 样受体水平较非感染组明显升高(P<0.05)，差异有统计学意义。提示孕母的Toll 样受体水平升高与新生儿宫内感染密切相关，见表4。

表4 感染组与非感染组孕母之间Toll样受体水平比较情况

3 讨 论

孕母的胎膜是把胎儿与外界环境相隔离开的天然保护屏障，给胎儿的生长和发育提供一个密闭又安全的环境条件，能够有效地阻止病原体等外界有害物质入侵胎儿体内对胎儿造成损害。正因如此，孕母胎膜的完整性在妊娠过程中对胎儿生长发育具有至关重要的影响[6]。胎膜早破的孕母在分娩前胎膜就发生破裂，失去完整性，从而导致胎儿失去了胎膜屏障的保护作用，孕母腹腔及阴道内的各种病毒及细菌能透过胎膜入侵胎盘，进一步造成了新生儿宫内感染，引起绒毛膜羊膜炎及新生儿宫内感染。

新生儿宫内感染在新生儿感染中占较大比例，也是早期新生儿死亡的主要原因之一。因此早期准确诊断新生儿宫内感染并及时使用抗生素是临床医生工作的一大重点和难点。胎膜早破合并宫内感染早期，多数无临床症状，如发展到临床绒毛膜羊膜炎出现典型的症状及体征后再予治疗，将大大增加母儿发病率和病死率。尽管有多个衡量感染的指标，但均存在特异性不高或所需时间较长等局限性，血培养作为细菌病原学检测的金标准，有培养时间长、易被污染等缺点，使得诊断不及时或漏诊影响检验结果。

C反应蛋白和降钙素原是目前广泛应用于临床的感染性生物标志物，但在部分非感染性疾病中也可呈高表达，不能准确反应机体的感染状态，特异性较低，且PCT受体内毒素以外多种介质影响，缺乏早期准确诊断的意义，给临床早期判断带来很大困难。羊膜腔内感染诊断的金标准是羊膜腔穿刺抽取羊水进行微生物培养，但是羊水穿刺为有创性操作，消毒不严可引起羊膜腔内感染；且细菌培养耗时过长，培养基的选择和抗生素的抑菌作用导致细菌培养的阳性率较低，这些原因使羊膜腔穿刺的临床意义不大。目前临床上对宫内感染的诊断主要依靠孕妇体温升高、羊水污染、母体心率和(或)胎心率加快等，但这些指标出现较晚，且特异性和敏感性均较差[7]。

Toll样受体是1997年Medzhitov[8]等第1次克隆人类Toll样受体，Toll样受体可以有效识别出各种病原菌，进而引发一系列的信号介导体内释放出炎症介质，启动机体的自然免疫反应并且激活获得性免疫系统，从而在抗感染的免疫机制中发挥出重要的作用。Toll 样受体是一类进化保守的胚系编码的模式识别受体，同时也是天然免疫系统中特异的病原式识别受体和I型跨膜受体，能够通过模式识别的方式来识别进而结合不同的病原菌的分子结构，启动体内的天然免疫系统[9]。Toll样受体在细胞信号转导和急性炎症反应中起着重要的作用，不同的Toll样受体识别的病源谱不同[10]，目前研究较多的是TLR-2和TLR-4，TRL-4主要可以识别真菌、热休克蛋白，特别是革兰氏阴性菌，而TLR-2主要识别分歧杆菌、疏密螺旋体和支原体，特别是能识别革兰氏阳性菌。

Kim等人的研究发现[11]，TLR4、TLR2在合并有绒毛膜羊膜炎的孕母中表达水平明显高于正常的孕母。曹耀辉在胎膜早破的孕母的胎盘组织中TLR2和TLR4的表达及与绒毛膜羊膜炎的关系的研究[12]中提示，TLR4和TLR2表达水平上升高，与胎膜是否完整无关，而是与孕母绒毛膜羊膜炎密切相关。本研究结果显示，感染组与非感染组新生儿相比较，感染组新生儿的白细胞水平、CRP 、PCT水平、血培养阳性率及新生儿存在感染表现的阳性率均明显比非感染组新生儿升高(P<0.05)；感染组新生儿的TLR-2mRNA及TLR-4mRNA水平在第1天及第7天时均较非感染组明显升高(P<0.05)；感染组孕母的Toll 样受体水平较非感染组明显升高(P<0.05)；提示孕母的外周血 Toll 样受体和新生儿的 Toll 样受体水平与新生儿宫内感染密切相关，母亲的阳性指标可用于指导新生儿宫内感染的早期诊断及临床治疗。

综上所述，有胎膜早破并有绒毛膜羊膜炎的孕母的外周血Toll样受体和新生儿的Toll样受体水平与新生儿宫内感染密切相关，可根据患儿母亲胎膜早破病史结合其TLR-2和 TLR-4 mRNA水平判断新生儿有无存在宫内感染，进而指导临床处理，改善母儿结局。