戴雯，张东晨

（安徽理工大学材料科学与工程学院，安徽淮南 232001）

在选煤厂中聚丙烯酰胺常用作絮凝剂对洗煤泥水进行絮凝沉降，聚丙烯酰胺的高分子侧链上带有大量的活性基团，因而具有良好的水溶性和絮凝性[1]。但残留于选煤厂循环水中的聚丙烯酰胺会影响浮选药剂的吸附率，此外若选煤厂循环水未得到妥善处理外排到环境中将会污染地下水[2]。微生物降解聚丙烯酰胺不会对煤炭洗选的其他工艺环节产生不利影响，同时具有生物降解性，降解产物对环境无毒、无害，不会产生二次污染，具有广泛的应用前景[3-7]。目前已有不少学者从环境中筛选出微生物菌种用于降解含聚丙烯酰胺废水，但环境菌种的降解率偏低，且菌种生长周期较长，不适于工业化生产[8]。探究复合菌种对选煤厂循环水中残留聚丙烯酰胺的降解效果对改善降解菌种对聚丙烯酰胺的降解特性有着十分重要的研究意义。

本文以淀粉-碘化镉试验测得的聚丙烯酰胺浓度计算得到的降解率为指标，考查了微生物降解菌球红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroides）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对聚丙烯酰胺的降解效果，重点研究了球红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroides）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）复合降解效果。采用正交试验设计，确定和分析了它们复合降解选煤厂循环水中残留聚丙烯酰胺的最优试验参数及因素影响显著性等。

1 试验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用含聚丙烯酰胺循环水

前期驯化试验过程中用取自淮南矿业集团望峰岗选煤厂的残留聚丙烯酰胺的浓缩池溢流液过滤灭菌后配制培养基驯化亲本菌种，后续试验中先用-0.5 mm的煤样配制浓度为40 g/L煤泥水，将煤泥水自然沉降后，取上清液过滤灭菌后用于配制含不同浓度聚丙烯酰胺的选煤循环水进行降解试验研究。

试验中采用的聚丙烯酰胺为阴离子型聚丙烯酰胺，相对分子量为1200万。

1.1.2 降解菌种

试验所用的球红假单胞菌及枯草芽孢杆菌为安徽理工大学矿业生物技术实验室保存的菌种。密封保存于冰箱中。

1.1.3 培养基

球红假单胞菌基础培养液（基）：蔗糖30 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.6 g、KH2PO4·3H2O 0.4 g、CaCl20.01 g 、Fe2（SO4）30.03 g、MgSO4·7H2O 0.06 g 、MnCl2·4H2O 0.3 g、微量元素5 mL、聚丙烯酰胺0.05 g、1 000 mL去离子水、（琼脂 20～25 g），pH=7。

枯草芽孢杆菌基础培养液（基）：葡萄糖20 g、KH2PO41 g 、K2HPO41 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、琼脂 20 g、超纯水 1 000 mL、（琼脂 20～25 g），pH=7。

降解培养液（基）：蔗糖 30 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.6 g、KH2PO4·3H2O 0.4 g、CaCl20.01 g、Fe2（SO4）30.03 g、MgSO4·7H2O 0.06 g 、MnCl2·4H2O 0.3 g、微量元素5 mL、聚丙烯酰胺0.05 g、1 000 mL去离子水、（琼脂20～25 g），pH=7。

微量元素：CuSO4·5H2O 0.4 g、ZnSO4·7H2O 0.6 g、MnCl2·4H2O 0.5 g溶于 500 mL 水。

菌种培养基分别采用BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器在121℃条件下灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 含聚丙烯酰胺选煤循环水的配制及相关性质测定

试验方法：用-0.5 mm的煤样配制浓度为40 g/L的煤泥水1 L，搅拌均匀，后置于1 L量筒中自然沉降3 h后，取上清液过滤灭菌后备用。称取不等量的聚丙烯酰胺配制含聚丙烯酰胺的循环水，利用淀粉-碘化镉方法测定循环水中聚丙烯酰胺的浓度。

1.2.2 菌种的活化

在无菌条件下将球红假单胞菌及枯草芽孢杆菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下长出完好的菌落，挑取菌落再转接到新鲜固体培养基上，等长出形态完好的菌落作为活化的菌种使用，并置于冰箱中保藏。

1.2.3 菌种的培养及生长量的测定

菌种培养：在无菌环境中用接种针挑取固体培养基上的菌样接种到液体培养基中，在30℃、转速为130 r/min的振荡培养箱中培养10 d；采用光电比浊计数法测定菌液的细胞总数，借助于紫外分光光度计，在波长600 nm下测定菌悬液的光密度值（OD值），测量值用于表征菌体的生长量[9-10]。以培养时间为横坐标，菌液吸光度值为纵坐标，绘制得到微生物生长曲线。

1.2.4 聚丙烯酰胺降解率的计算

采用淀粉-碘化镉法测定液体环境中聚丙烯酰胺的浓度[11-14]。用吸光度（A）来表征聚丙烯酰胺浓度，用UV－5100紫外可见分光光度计测定吸光度，并绘制质量浓度与吸光度之间的标准曲线。

采用淀粉-碘化镉方法测定聚丙烯酰胺生物降解前后的质量浓度，计算出选煤循环水中残留聚丙烯酰胺的降解率（%），降解率的表达式为[15]：

式中：c0—生物降解前聚丙烯酰胺的质量浓度，mg/L；ct—生物降解后聚丙烯酰胺的质量浓度，mg/L。

1.2.5 聚丙烯酰胺复合降解菌种的生长和降解特性研究方法

试验方法：利用实验室模拟选煤循环水配制聚丙烯酰胺浓度为500 mg/L的降解培养液100 mL，接入体积比为2%的复合菌菌悬液，两种菌悬液的添加量比例为1∶1。调节培养液的pH值为7，将培养液置于温度为30℃、转速为130 r/min的振荡培养箱连续培养10天；每天测定降解培养基中聚丙烯酰胺浓度的变化及细菌的生长量，并依降解曲线确定后续试验适宜时间。

1.2.6 底物浓度对复合降解菌种生长和降解特性影响的研究方法

试验方法：利用实验室模拟选煤循环水配制聚丙烯酰胺浓度分别为 100 mg/L、300 mg/L、500 mg/L、700 mg/L、1 000 mg/L的降解培养基，按2%的体积比接入复合降解菌悬液，两种菌悬液的添加量比例为1∶1。调节培养液的pH值为7，将培养液置于振荡培养箱，在温度30℃、转速130 r/min条件下连续培养至已确定的适宜时间；取样测定降解培养液中聚丙烯酰胺浓度的变化及细菌的生长量，并依降解曲线确定复合降解菌株适宜聚丙烯酰胺的底物浓度范围及最适底物浓度。

1.2.7 空白对照组的设置

以等底物浓度的无菌溶液作为对照组，以接种等体积的无菌水作为对照。在相同的培养环境下放置相同时间，取样测定降解培养液中聚丙烯酰胺浓度的变化。

1.2.8 单菌种降解聚丙烯酰胺的研究方法

配制聚丙烯酰胺浓度为500 mg/L的降解培养基，以球红假单胞菌与枯草芽孢杆菌分别作为降解菌，接入体积比为2%的菌液，按照复合菌种降解聚丙烯酰胺的最优试验条件进行降解培养，连续培养7天，每天测定降解培养基中聚丙烯酰胺浓度的变化并绘制降解特性曲线，计算出培养阶段的最高降解率。

1.2.9 复合降解菌种降解聚丙烯酰胺的正交试验设计

查阅相关文献可知，培养温度、pH、菌液添加量等均对复合降解菌种的聚丙烯酰胺降解效果有一定影响[16-19]。采用正交试验方法设计复合降解菌降解聚丙烯酰胺的试验方案。采用L9（33）正交试验设计，主要考查培养温度、pH、菌液添加量对复合降解菌种的聚丙烯酰胺的降解效果。以聚丙烯酰胺的降解率作为试验指标，试验中不考虑各因素间的交互作用。接种的菌液采用培养两天的菌液，正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 The factor level table of orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 聚丙烯酰胺复合降解菌的生长特性分析

根据测定的试验数据绘制复合降解菌株的生长曲线和降解率曲线如图1所示。

图1 复合降解菌的生长及降解曲线Fig.1 Growth curve and degradation curve of composite strain

由图1可知，培养过程中复合降解菌种的生长量和聚丙烯酰胺的降解率均呈现先逐渐升高而后趋于稳定的变化趋势。在l～3 d为复合降解菌适应期，复合降解菌生长速度较慢，聚丙烯酰胺降解率变化较小；在3～5 d复合降解菌种开始进入生长对数期，菌种量迅速增加，聚丙烯酰胺降解率也迅速增大，一直持续到第7 d；7 d后菌种开始逐渐进入衰亡期，菌种量及聚丙烯酰胺的降解率均趋于一个较大的稳定值。在降解培养的初期时间段内，降解菌种逐渐适应培养环境，培养基中营养物质充分，因此降解菌种迅速生长繁殖。随着培养时间的延长，培养液中的降解菌量不断增多，但营养物质逐渐枯竭，会抑制甚至削减降解菌量，同时长时间的培养聚丙烯酰胺对生物菌种会显现毒害作用，减弱降解菌种对聚丙烯酰胺的降解效果。综合考虑降解周期及降解效果等因素，根据图中复合降解菌种的生长曲线及聚丙烯酰胺降解率的变化情况，可确定在后续试验中选取培养时间7 d作为菌种连续培养的最佳时间。

2.2 底物浓度对复合降解菌生长和降解特性的影响

根据测定的试验数据绘制底物浓度对复合菌的生长量及降解率的影响变化曲线，见图2。

图2 底物浓度对复合菌种生长量和降解率的影响Fig.2 Effects of the substrate concentration on the growth and degradation rate of compound bacteria

从图2可以看出，聚丙烯酰胺降解率及复合降解菌的生长量随底物浓度的变化趋势大致相同，均呈现开始逐步升高，达到一定数后又逐渐降低的变化趋势。底物浓度在300～700 mg/L之间时，复合降解菌具有较高的生长量及聚丙烯酰胺降解率，在此浓度区间内复合菌的适应能力较好。分析可知，底物浓度的高低关系到培养基中碳源及氮源的高低，在低底物浓度的培养基中，降解菌种无法摄取到充足的氮源，影响复合降解菌的生长繁殖；在底物浓度高的降解培养中，降解菌种能够充分摄取生长繁殖所需的碳源及氮源，但底物浓度过高时，聚丙烯酰胺对降解菌种会呈现生物毒性，影响降解菌种的生长繁殖及降解能力。结合底物浓度对降解及生长的影响曲线综合考虑，培养基中复合降解菌的适宜聚丙烯酰胺浓度为300～700 mg/L，在后续试验中选取聚丙烯酰胺浓度为500 mg/L作为最适底物浓度。

2.3 微生物及非生物絮凝剂对煤泥水絮体的助滤效果

将复合降解菌在灭菌后的降解培养基中连续培养7 d，根据测定的试验数据整理后试验结果见表2。

表2 复合降解菌降解试验结果Tab.2 Experimental results of polyacrylamide degradation by compound bacteria

2.4 复合降解菌降解聚丙烯酰胺的正交试验结果分析

根据试验结果对试验指标聚丙烯酰胺降解率进行分析，计算结果如表3。

表3 正交试验均值响应表Tab.3 The mean response of orthogonal experimental

通过直观分析[20]，确定了各试验因素影响复合降解菌降解聚丙烯酰胺特性试验结果的主次顺序为A＞B＞C，培养温度A3对试验指标影响最大，其次是培养基初始pH值B2对试验指标有较明显影响，菌液添加量C2对试验指标的影响较弱。由试验结果分析可得，考查因素对试验指标的影响顺序为：A3＞B2＞C2。最优因素水平为培养温度为35℃，pH为7，菌液添加量为2 mL。在最优条件下进行试验时，复合降解菌对聚丙烯酰胺的降解率为39.24%。

2.5 空白对照组中聚丙烯酰胺自然降解结果与分析

将灭菌后的聚丙烯酰胺溶液连续培养10 d，根据测定的试验数据绘制自发降解率曲线，如图3所示。

图3 空白对照组试验Fig.3 Blank experimen

从图3可以看出，在空白对照组中，聚丙烯酰胺的自然降解速度缓慢，连续培养7 d时聚丙烯酰胺的自发降解率为2.58%。此部分的降解主要是由于在振荡培养箱中振荡培养时与容器碰撞发生了机械降解。自然环境中的聚丙烯酰胺自发降解率低且降解周期长。

2.6 单菌种降解聚丙烯酰胺的结果与分析

将球红假单胞菌在灭菌后的降解培养基中连续培养7 d，根据测定的试验数据绘制降解率曲线，如图4所示。

图4 球红假单胞菌对聚丙烯酰胺的降解曲线Fig.4 Degradation curve of polyacrylamide by R.S

从图4可以看出，在复合菌降解聚丙烯酰胺的最优试验条件下，连续降解培养7 d，球红假单胞菌降解聚丙烯酰胺的最终降解率为24.9%。由此可以看出，球红假单胞菌对聚丙烯酰胺有明显的降解效果，但对聚丙烯酰胺的降解效果不如复合菌种。

将枯草芽孢杆菌在灭菌后的降解培养基中连续培养7 d，根据测定的试验数据绘制降解率曲线，如图5所示。

图5 枯草芽孢杆菌对聚丙烯酰胺的降解曲线Fig.5 Degradation curve of polyacrylamide by Bacillus subtilis

从图5可以看出，在复合菌降解聚丙烯酰胺的最优试验条件下，连续降解培养7 d，枯草芽孢杆菌降解聚丙烯酰胺的最终降解率为22.13%，可以看出枯草芽孢杆菌单独降解聚丙烯酰胺时其降解效果明显不如复合菌种对聚丙烯酰胺的降解力度。

3 结论

通过试验研究与分析，可以得出如下结论：

（1）在复合降解菌种降解聚丙烯酰胺的正交试验考查的因素水平中，各试验因素对降解效果影响的主次顺序为培养温度＞pH值＞复合降解菌菌液添加量，其中，复合降解菌培养温度对聚丙烯酰胺有显著影响，pH值和复合降解菌菌液添加量对于试验指标没有显著影响。复合降解菌降解聚丙烯酰胺特性的最优因素水平组合为培养温度为35℃，降解培养基初始pH值为7，菌液添加量为2 mL。

（2）微生物降解菌球红假单胞菌和枯草芽孢杆菌均可有效地降解选煤循环水中残留的聚丙烯酰胺，改变循环水中聚丙烯酰胺的浓度，分别添加时聚丙烯酰胺的降解率分别为24.9%、22.13%，自然降解的降解率为2.58%。

（3）微生物菌种球红假单胞菌与枯草芽孢杆菌复合添加时的降解效果优于单一添加微生物降解菌或自然降解的降解效果。最优试验条件下，球红假单胞菌与枯草芽孢杆菌复合降解选煤循环水中残留的聚丙烯酰胺，降解率为39.24%。

（4）微生物菌种在降解聚丙烯酰胺时，菌种在培养前期阶段逐渐适应降解培养基环境，在此阶段菌种生长较慢，降解率也不高；在菌种逐渐适应生长环境后，其繁殖速度加快，生长快速，对聚丙烯酰胺的降解率也逐渐增大；当菌种进入生长衰亡期时，菌种会大量死亡，聚丙烯酰胺的降解率甚至会减弱。