王 刚， 胡俊强， 史建荣， 徐剑宏

[江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(南京)/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏南京 210014]

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)又称呕吐毒素，是一种危害巨大的真菌毒素，主要由镰刀菌产生，常见于受赤霉病侵害的谷物籽粒中。针对DON的毒理学研究表明，DON可以阻滞细胞周期并引发细胞凋亡，进而对哺乳动物的肠道上皮细胞产生毒害，阻碍肠道上皮细胞增殖与分化，同时DON也会引发肠道炎症反应，造成呕吐、腹泻等病症[1]。相关研究表明，DON还具有血液毒性、骨髓毒性以及致癌性[2-3]，因此DON毒素对于食品安全存在重大威胁。根据最新的GB 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》，我国对谷物及其制品中DON的限量标准为 1 000 μg/kg。

江苏省近年来谷物中DON毒素污染情况严重，根据笔者调研结果，2015、2016年江苏省小麦中DON毒素平均含量分别为(2 087±112) μg/kg、(2 601±126) μg/kg，其平均含量已超过限量标准2倍，超标率均在70%以上[4]。由于DON毒素污染，农户近年来蒙受了重大经济损失。因此，DON的脱毒处理手段对于保障谷物食品安全、维护农户经济利益具有重大意义。

针对DON毒素的毒理学研究与脱毒研究需要大量DON纯品，但目前DON纯品价格极高，严重限制了相关研究的开展。由于DON毒素立体结构复杂，手性中心众多，因此针对DON的全合成工艺至今仍未开发成功。国内外均有关于从镰刀菌发酵物中提取并分离DON毒素的报道，其分离手段包括硅胶柱色谱、制备型液相以及高速逆流色谱等，其产量最高达每批次100 mg左右[5-8]。

大孔吸附树脂是一类内部具有孔洞结构的交联高分子材料，由于其具有高吸附容量以及可再生的优点，因此被广泛应用于天然产物的分离纯化中，其纯化原材料来源包括细菌发酵液[9]、真菌发酵液[10-11]、植物组织[12-13]甚至动物组织[14]。然而单一运用大孔吸附树脂难以获得高纯度化合物[15]，往往还需要后续精制纯化手段。高速逆流色谱是一类基于液液分配原理的液相色谱系统[16]，尤其适合天然产物的纯化。大孔吸附树脂与高速逆流色谱均具有成本低、适用范围广的优势，因此，关于二者联用分离纯化天然产物的研究时常见诸报道[17-18]。

本研究介绍了1种大孔吸附树脂层析与高速逆流色谱联用的技术；首先接种禾谷镰刀菌菌株PH-1至大米培养基中进行固体发酵，之后以甲醇水溶液(体积分数为85%)提取发酵物中的DON，提取物经大孔吸附树脂初步纯化后，用高速逆流色谱进行精制，最终获得纯度达96.78%的DON化合物，每批次可以获得500 mg以上的毒素纯品，为后续毒素降解研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂 DON毒素标准品，购自上海Romer Labs公司；色谱纯甲醇，购自德国Merck公司；CDCl3，购自美国Cambridge Isotope Laboratories公司；其他试剂均为国产分析纯。

大孔吸附树脂XAD-2、XAD-4、XAD-7HP、XAD-11180、XAD-1180N与阴离子交换树脂FPA91-OH、IRA67均购自美国Sigma-Aldrich公司。大孔吸附树脂在使用之前均用甲醇浸泡24 h，再用去离子水彻底冲洗至流出液不含甲醇，阴离子交换树脂在使用之前以饱和NaCl溶液浸泡24 h，再用去离子水彻底冲洗。

大米培养基成分为350 g大米与120 mL去离子水，混合均匀后进行高压蒸汽灭菌处理。

1.1.2 仪器 主要仪器包括OptiChrome-300 PLUS(高速逆流色谱仪)，江阴逆流科技公司；Waters e2695高效液相色谱仪(HPLC)，美国Waters公司；AB Sciex 5600(高分辨质谱仪)，美国AB Sciex公司；DRX-600(核磁共振波谱仪)，德国Bruker公司。

1.2 DON的分析定量方法

利用Waters e2695高效液相色谱仪检测样品中的DON含量，采用外标法对DON进行定量。色谱柱为ACE C18柱[十八烷基硅烷(ODS)，4.6 μm×150 mm，5 μm，Phenomenex]，柱温为35 ℃，流动相为33%甲醇水溶液，流速为0.6 mL/min，检测波长为218 nm。该色谱条件下DON的保留时间为6.8 min。

每组试验均设置3组平行试验，最终检测结果以3组试验的平均值表示。

DON在树脂上的吸附率用如下公式表示：

式中：Qe表示树脂吸附容量(μg/g)；C0、Ce分别表示样品溶液初始DON浓度以及吸附后残留DON浓度(μg/mL)；V0表示初始样品溶液体积(mL)；m表示树脂质量(g，干质量)。

1.3 固体发酵与样品制备

将禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)接种至PDA培养基上，于25 ℃培养7 d，将菌丝体接种至大米培养基上，于 25 ℃ 培养21 d。

发酵结束后将大米烘干，粉碎；用1 L 85%甲醇溶液提取DON毒素，共提取2次，合并提取液，减压蒸馏至干，残余油状物即为供试样品。

1.4 大孔吸附树脂柱色谱参数优化

1.4.1 不同树脂对DON的吸附容量测定 用10%乙醇溶液重悬供试样品，至DON终浓度约为500 μg/mL。取50 mL溶液加入250 mL三角烧瓶中，加入1 g预处理树脂，室温下振荡吸附12 h。取上清溶液，以甲醇稀释10倍后用HPLC法检测DON含量。

1.4.2 XAD-4树脂吸附条件的优化 取1 g预处理的 XAD-4树脂，加至50 mL供试溶液中，分别调节供试溶液pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)以及吸附温度(25、30、35、40 ℃)，振荡吸附12 h。取上清溶液，以甲醇稀释10倍后用HPLC法检测DON含量。

1.4.3 吸附等温线方程 分别取1 g预处理的XAD-4树脂，加入含有不同浓度DON的供试溶液，以最佳吸附条件静态吸附2 h，取上清用HPLC法检测残余DON含量，计算不同浓度下树脂吸附容量，并作出吸附等温线。

采用Langmuir吸附模型与Freundlich吸附模型拟合吸附行为。

Langmuir吸附方程：

Freundlich吸附方程：

式中：Qe为吸附容量；Ce为吸附达到平衡时溶液中DON浓度；Qm为Langmuir模型中的理论最大吸附量；KL、KF、1/n为经验常数。

1.4.4 洗脱条件的优化 称取9份已吸附饱和的XAD-4树脂各1 g，分别用不同质量浓度的乙醇溶液进行解吸附，检测洗脱溶液中的DON浓度。

确定最优洗脱浓度后，取20 g吸附饱和的XAD-4树脂装入玻璃层析柱，以乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2 BV/h，分部收集流出液，检测DON浓度。流出液经减压蒸馏至干，供高速逆流色谱分离纯化。

1.5 高速逆流色谱纯化DON毒素

将去离子水与等体积乙酸乙酯混合，充分混匀后静置过夜分层，分离上下相，即为高速逆流色谱溶剂系统。将上相以20 mL/min流速泵入高速逆流色谱，随后以1.5 mL/min流速泵入下相，同时开启旋转，转速设置为1 040 r/min，待系统平衡。

将经大孔吸附树脂处理后的样品用少量下相溶解，通过进样阀泵入高速逆流色谱仪，以1.5 mL/min流速洗脱，检测波长为220 nm。

分部收集流出液，合并富含DON的馏分，通过N2吹扫去除部分溶剂，剩余溶液置于冷藏室进行结晶，将得到的晶体分别以色谱纯甲醇或CDCl3溶解，用LC-MS(液相色谱-质谱联用)与NMR(核磁共振)法测定其分子量及分子结构。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂的筛选

本研究选取了5种大孔吸附树脂与2种阴离子交换树脂(表1)，分别检测其对发酵提取物中DON的吸附能力。静态吸附试验结果表明，XAD-4树脂对于DON的吸附容量最高，达545.76 μg/g(图1)，因此选用XAD-4树脂作为吸附剂进行DON毒素的纯化。

从表1可以看出，阴离子交换树脂对于DON的吸附能力明显低于大孔吸附树脂，考虑到阴离子交换树脂的吸附取决于被吸附物质的解离状态，因此，笔者推测在中性pH值条件下DON主要以分子形式存在。

2.2 吸附参数的优化

由于环境因素如温度、pH值等均会对大孔吸附树脂的吸附容量产生影响，因此对吸附时的温度、pH值均进行了初步优化。从图2-A可以看出，随着温度的上升，DON的吸附容量逐渐降低。由于吸附过程在通常情况下是放热行为，因此该现象符合勒夏忒列原理。从图2-B可以看出，当吸附溶液pH值在7～8范围内时，DON的吸附容量最高，但在一个较广泛的pH值5～9范围内，DON的吸附容量没有明显变化，说明DON在此pH值范围内并无明显解离现象。

表1 选用的树脂及其理化性质

注：ND表示无可靠数据。

2.3 吸附行为热力学研究

在描述吸附行为时，Langmuir吸附模型与Freundlich吸附模型是最为常用的2种热力学模型。通常来说，Langmuir吸附模型更适合用于描述单分子层吸附行为。2种吸附模型的具体参数见表2。可以看出，在温度为25 ℃条件下，XAD-4对DON的吸附行为更符合Langmuir吸附模型，其线性方程的相关系数达到0.999 7，而Freundlich吸附模型中线性方程的相关系数只有0.790 4。表明XAD-4树脂对DON的吸附行为更符合单分子层吸附模式，XAD-4树脂在25 ℃条件下对DON的理论最大吸附量为769.23 μg/g(图3)。

2.4 洗脱条件的优化

由于乙醇溶液具有廉价易得、低毒环保的优点，因此通常情况下均采用乙醇溶液作为大孔吸附树脂的洗脱溶液。本试验中筛选了质量浓度范围在10%～100%的乙醇溶液，分别考察其对XAD-4树脂吸附DON的洗脱能力。从图4-A可以看出，当乙醇浓度达30%时，其对DON的洗脱率已超过80%，因此，选择30%乙醇溶液作为洗脱溶剂。

表2 XAD-4树脂对DON吸附行为的Langmuir与Freundlich等温吸附模型参数

之后又采用20 mL大孔吸附树脂柱进行动态洗脱，洗脱溶剂为30%乙醇溶液，洗脱曲线见图4-B，可见DON在 3 BV 范围内即可基本洗脱完毕。

2.5 高速逆流色谱的最终纯化

采用高速逆流色谱作为最终纯化手段，选用相关文献报道的溶剂体系[7]，以乙酸乙酯-水(体积比=1 ∶1)作为双相体系，采用有机相作为固定相，以水相作为流动相，对经过大孔吸附树脂初步纯化的样品进行精制。从图5可以看出，DON组分在150 min开始流出，至180 min基本结束。收集相关组分，经过N2吹扫出去部分溶剂后，采用低温结晶的方法获得DON晶体，通过HPLC及NMR检测其纯度，得到的DON晶体纯度达 96.78%(图6)，最终回收率为76.20%。

3 结论与讨论

本研究介绍了1种通过大孔吸附树脂柱层析与高速逆流色谱联用技术分离纯化真菌毒素DON的方法，通过该方法可以获得纯度达96.78%的DON纯品，并且一个批次可以制备超过500 mg毒素纯品。该方法较为简便，并且步骤较少，易于放大，因此有助于快速获得大量毒素纯品以供后续相关研究。

目前，大孔吸附树脂纯化技术常用于液体样品的净化处理，但限于DON毒素在液体培养基中产量较低，因此本研究采用大米发酵物作为毒素来源，导致杂质较多，前处理步骤较为繁琐。在后续研究中，笔者计划对液体发酵条件进行优化，同时拟对高产毒菌株进行基因操作，以期获得能够在液体培养基中大量产生毒素的菌株，便于进一步放大毒素生产规模。