王 鹏， 王丹丹

(辽东学院农学院，辽宁丹东 118003)

艳红桃(PrunuspersicaL.)为多年生果树，原产于我国，主要集中在黄河及长江流域。桃果实为跃变型果实，其呼吸强度的变化模式是在果实发育定型之前，呼吸强度不断下降，在成熟开始时，呼吸强度会骤然升高，达到峰值后便快速下降，同时，在呼吸跃变期间，果实体内生理代谢发生了根本性的转变，是果实由成熟向衰老转化的转折点，因此，跃变型果实贮运时，要在呼吸跃变出现前进行采收[1-3]。

跃变型果实对乙烯很敏感，它的成熟需乙烯催化，而桃不同于其他典型的跃变型果实，其在成熟期间内源性乙烯产生较少，因此，种植者为了加快采收后桃的成熟，进而产生更高的商业价值，大多采用乙烯利处理果实；但如果果实能在枝上成熟，则其可能更有市场、更受消费者的欢迎[4]。

脱落酸(abscisic acid，简称ABA)为植物生长发育过程中重要的内源调控因子，低浓度可促进果实成熟，高浓度可抑制果实成熟[5-7]；ABA在未成熟的跃变型果实(如桃子、西红柿等)中浓度较低，但果实成熟时其浓度会增加，可见，ABA在调节跃变型果实成熟过程中起关键作用；研究表明，ABA参与了西红柿中乙烯的大量合成并加速其果实的成熟，乙烯生物合成途径首先是由甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，简称SAM)，SAM在1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo propane-1-carboxylic acid，简称ACC)合酶的作用下合成ACC，ACC在ACC氧化酶作用下生成乙烯[8-11]，而外源ABA处理果实可提高ACC合成酶和ACC氧化酶的活性，使乙烯释放量增加，促进乙烯释放高峰期的出现；ACC合成酶(1-aminocycl propane-1-carboxylic acid synthase，简称ACS)在乙烯合成过程中催化S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adometsynthetase，简称SAMS)合成ACC，是乙烯合成过程中的限速酶。去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid，简称NDGA)可抑制ACC合酶和ACC氧化酶的活性，从而降低乙烯的释放量并使乙烯释放高峰延缓出现，其不仅能阻断胁迫诱导的ABA积累，又能抑制ABA在果实中的合成，其抑制程度随浓度升高而增强，NDGA抑制ABA的合成是通过抑制9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，简称NCED)的含量与活性实现的，而NCED能够促进ABA的合成，是高等植物内源性ABA合成过程中关键的限速酶[12-13]。

目前，专家们对植物内源激素乙烯、ABA对果实成熟的调控作用以及二者的相互关系做了大量的研究工作，但关于乙烯和脱落酸对采收前果实成熟作用的研究较少。本试验采用250 μL/L乙烯利、100 μmol/L ABA和100 μmol/L NDGA处理采收前盛花90 d的艳红桃果实，并取样分析；采用实时定量PCR技术分析PpNCED2基因的表达水平，并构建艳红桃PpNCED2与其他植物NCED的系统发育树，以期加快未采收果实的熟化过程，使果实提前进入市场。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

以4～6年生的艳红桃为研究对象，源自辽宁省丹东市宽甸果园，各植株生长健壮且树势基本一致。试验设4组，每组随机选取70个90 d(盛花后天数，days after full bloom，以下简称DAFB)艳红桃果实，以果皮颜色开始变化开始；第1组将枝上果实浸泡于250 μL/L乙烯利和5%乙醇溶液中 1 min；第2组将枝上果实浸泡于100 μmol/L ABA与5%乙醇溶液中1 min；第3组将枝上果实浸泡于100 μmol/L NDGA与5%乙醇溶液中1 min；第4组将枝上果实浸泡于5%乙醇溶液中1 min，作为对照组；经上述处理后分别在0、2、4、6、8、10、12 d时采收果实，每次每组采收10个果实，对果实硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量及乙烯释放量进行测定；此外，将部分果肉存于液氮中，用于提取RNA及分析ABA浓度等。

1.2 果实硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量的测定

果实硬度采用FT-327型果实硬度计测定；可溶性固形物含量采用LH-B55手持测糖仪测定；可滴定酸含量采用水果酸度计检测。

1.3 ACS、ACO活性与ACC浓度、乙烯释放量和ABA浓度的测定

ACS、顺乌头酸酶(aconitase，简称ACO)活性与ACC浓度、乙烯释放量的测定均采用酶联免疫吸附测定法(ELISA试剂盒)，其中桃果实内源ABA提取、纯化按照Silva等的方法进行[14]。

1.4 PpNCED2基因的实时定量PCR分析

分别将各组样本于液氮中研磨成粉，用于提取总RNA，采用植物总RNA抽提试剂盒提取；采用SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase试剂盒对提取的RNA进行反转录，RT-PCR体系参照2xSG Fast QPCR Master Mix试剂盒。采用PrimerExpress软件设计基因PpNCED2实时荧光定量PCR引物，同时设计内参基因Elongationfactor-1α的引物(表1)。QRT-PCR体系共20 μL：RT-PCR mixture 10.0 μL，引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA(50～100 ng/μL)2.0 μL，ddH2O 7.0 μL；反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 1 min，50 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。本试验所有试剂及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.5 构建PpNCED2基因系统发育树

采用NCBI BLAST数据库搜索PpNCED2的近缘基因；并采用DNAMAN 8.0软件分析程序(Lynnon Biosoft，美国)进行PpNCED2与其他NCED基因的同源性分析及系统发育树的建立。

1.6 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行统计、作图分析。

2 结果与分析

2.1 试验处理对艳红桃品质的影响

由图1可知，乙烯利处理后4 d，果实的硬度明显低于其他组，且处理后10 d果实已可食用，其他3组果实硬度无明显变化；可溶性固形物含量在乙烯利处理后的4 d明显增加；可滴定酸含量在乙烯利处理后下降明显；其中，12 d时，经过处理的果实中，可溶性固形物含量明显高于对照组；采用乙烯利处理后10 d，果实已可食用，但落果率仅为5%，明显优于其他处理方式；而采用ABA处理的果实落果率与对照组无明显差异，采用NDGA处理的果实在处理后12 d时开始落果，较其他组慢。

2.2 试验处理对艳红桃乙烯代谢的影响

由图2可知，ACC含量在采用乙烯利处理后10 d达到最高值，而后迅速下降；采用ABA处理后6 d， ACC较其他3组低，此后，ABA、NDGA以及对照组ACC含量无较大差异。采用乙烯利、ABA和NDGA处理后10 d，ACO活性均整体增强，此后活性下降，其中采用乙烯利处理ACO活性增强效果明显，而对照组在处理后6 d便有下降趋势。乙烯利处理下，ACS活性在处理后6 d呈明显增强趋势，在处理后10 d达到峰值，而后略有下降，但较其他3组增强效果明显。采用乙烯利处理后2～10 d，乙烯释放量较其他3组明显增加，在处理后10 d达到最高值，而后有迅速下降趋势。可见，采用乙烯利处理果实，ACC含量、ACO活性增强效果明显，有利于桃果实内源乙烯的合成，从而加快果实的熟化速度。

2.3 试验处理对ABA浓度及PpNCED2表达水平的影响

由图3可知，PpNCED2基因的表达水平，在采用ABA处理后4、6 d明显增加，乙烯利处理后PpNCED2基因略有表达，其他2组表达水平不明显。采用外源性ABA处理艳红桃果实，检测到的内源性ABA浓度均高于其他3组，而采用乙烯利处理果实，检测发现，内源性ABA的释放与对照组相比未见明显变化。可见，NCED能够促进内源ABA合成，是高等植物内源性ABA合成过程中关键的限速酶。

2.4 构建PpNCED2基因的系统发育树

采用DNAMAN 8.0软件对艳红桃PpNCED2基因全长序列进行分析，对艳红桃与其他12种植物NCED基因编码的氨基酸进行同源性分析，构建系统发育树，由图4可见，艳红桃PpNCED2与沙梨PpNCED3同源性较高(91.25%)，将二者的氨基酸序列进行比对分析发现，氨基酸序列相似度较高，仅在N端区域有较小差异；说明NCED基因是大部分植物ABA合成过程中的关键酶基因。

3 结论

乙烯是植物的一种内源激素，虽然结构简单，但参与植物发育过程的很多阶段，包括细胞延长、种子萌发、果实成熟、器官衰老、根的结瘤、程序性细胞死亡、脱落、对环境胁迫的响应和病原体的侵染等；肉质果实的成熟表现为发育过程和生化通路的协调作用，这些作用可导致果实颜色、质地的改变、营养成分的积累、香气的产生以及种子的形成等。乙烯在许多果实的成熟中发挥关键作用，例如芒果、香蕉、梨和西红柿等，可通过促进乙烯的合成来达到对跃变型果实成熟的调控。

本试验结果显示，艳红桃果实采收前，采用乙烯利处理桃果实，可快速降低果实硬度、增加果实可溶性固形物含量，可见，乙烯信号转导能加快淀粉转化为糖的速度，同时减少可滴定酸的含量。此外，使用外源性ABA可诱导PpNCED2基因的表达，增加内源性ABA的浓度，可见，ABA能够激活NCED基因的表达，而该基因是ABA合成途径中关键酶基因的上游调控因子，但果实的硬度、可滴定酸的含量等与对照组相比并无较大差异。综上所述，在果实熟化过程中，乙烯的调控占主导地位，乙烯能刺激细胞膜透性增加，使呼吸作用加快，促使果肉内有机物的强烈转化，以达到可食的程度，如果没有乙烯，成熟过程无法完成，果实味道变差。Zaharah等报道，芒果呼吸跃变期，ABA的大量积累能够促进果实熟化过程中乙烯的释放量的增加；成熟发生时，ACO的活性迅速升高，接着又急剧下降，随着跃变的发生，ACO含量升高，且在之后的成熟过程中依然维持一个相对较高的量，尽管ACO含量已快速下降；而ABA通过增强ACS、ACO的活性和ACC的积累，加快乙烯生物合成的效果[15]。

综上所述，采收前，采用乙烯利处理桃果实能够加快果实的软化，增加可溶性固形物的含量，减少可滴定酸的含量；并且在乙烯利处理后10 d，果实即可食用，而落果率仅为5%，明显优于其他几种处理方式；因此，采收前，可采用乙烯利处理桃果实，以加快果实成熟，提早进入市场，提高经济效益。但是，乙烯也是一把双刃剑，既能促进高品质果实的产生，也能在果实成熟后期刺激果实过度成熟甚至腐烂，因此，未来通过控制乙烯的生物合成或乙烯的响应以阻止或延缓果实的成熟在农业和食品工业都尤为重要。