王霞霞， 高 平， 李 栋， 郝旺林， 何 真

(1.吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033000； 2.山西省农业科学院，山西太原 030006)

银杏(GinkgobilobaL.)为银杏科银杏属落叶乔木，别称白果、公孙树、鸭脚树、蒲扇[1-3]，素有裸子植物“活化石”之称，为中国独存的珍稀名贵树种[4-6]。银杏及其愈伤组织中含有黄酮、双黄酮等黄酮类化合物[7]，对心脑血管疾病具有独特疗效[8-9]，因此银杏叶提取物及其制剂在国际市场上供不应求[3]。自然条件下，银杏叶中黄酮含量也较高[10]。但银杏栽培需要大量面积，生长周期长，且易受多种外界条件影响[11-12]。近年我国研究人员发现诱导的银杏愈伤组织中也含有黄酮类物质，目前有利用银杏愈伤组织的细胞悬浮培养来生产黄酮类次生代谢产物的研究[13-15]。从愈伤组织中提取黄酮类物质，能有效缩短生产周期，满足工业化生产需要[1]，对黄酮类物质生产量提高和加工产业发展有重大意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

银杏叶片、叶柄、树皮等外植体均采自吕梁学院校园内银杏树。

1.2 试验方法

采用L9(34)正交设计表选择最适合外植体的消毒配比，外植体(A)选择叶片、叶柄、树皮。将10%次氯酸钠消毒时间(B)设计为3个梯度3、6、9 min，将75%乙醇消毒时间(C)设计为3个梯度分别为40、50、60 s(表1)。

表1 外植体和消毒时间的正交设计因素和水平

采用L9(34)正交设计表选择诱导银杏愈伤组织最适宜激素种类和浓度配比，KT水平设置为0、0.2、0.4 mg/L，6-BA水平设置为0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平设置为0、0.5、1.0 mg/L(表2)。

表2 诱导愈伤组织的正交设计因素和水平

采用L9(34)正交设计表选择愈伤组织增殖最适宜激素浓度配比，KT水平设置为1.0、1.5、2.0 mg/L，6-BA水平设置为0.5、1.0、1.5 mg/L，2，4-D水平设置为0.0、1.0、2.0 mg/L，NAA水平设置为0.5、1.0、1.5 mg/L(表3)。

表3 愈伤组织增殖的正交设计因素和水平

1.3 双黄酮提取

应用十字交叉法随机取样愈伤组织，放置在60 ℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒质量；把烘干的愈伤组织置于研磨器中研磨成粉末，在冷冻箱中冷冻保存备用。

用醇提法[16]提取愈伤组织中的双黄酮；以芸香苷为标准品制作标准曲线[17-18]，采用高效液相色谱仪[19-20]测量双黄酮的含量。

1.4 计算及数据处理

存活率=存活的外植体数/接种的外植体数×100%；

愈伤组织诱导率=诱导产生愈伤组织的个体数/存活个体数×100%；

愈伤组织增殖倍数=(培养30 d后装有愈伤组织培养皿质量-取出愈伤组织培养皿质量)/(接种愈伤组织后培养皿质量-接种前装有培养基的培养皿质量)。

数据用SPSS软件处理。

芸香苷标准曲线方程为：y=0.062 4x+13.943 6；双黄酮得率依据梁文惠等的方法[18]计算。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂消毒时间对不同外植体成活率的影响

由表4可知，叶片作为外植体成活率明显高于叶柄和树皮。10% NaClO消毒时间6 min成活率明显高于3 min和 9 min，说明10% NaClO消毒时间过长和过短都不利于外植体的成活。75%乙醇消毒时间为40 s成活率高于50 s和 60 s，说明乙醇消毒时间不宜过长。又经极差分析可知，外植体、10% NaClO、75%乙醇的成活率极差分别为13.36、26.75、9.30百分点，因此，影响外植体成活的主次关系为：10% NaClO>外植体>75%乙醇。由此可得到最优水平组合为A1B2C1，即外植体为叶片、10% NaClO消毒时间为6 min，75%乙醇消毒时间为40 s。

表4 不同消毒时间外植体成活率L9(34)正交试验结果

将上述最优消毒条件组合进行一次验证试验，得到外植体成活率为84.21%，高于表4中所有9组试验的成活率，故确定最优试验组合为A1B2C1。

2.2 不同激素浓度对愈伤诱导的影响

由表5可知，0.2 mg/L的KT诱导率均高于不加KT和0.4 mg/L KT，说明KT浓度过低和过高都不利于诱导愈伤组织。1.0 mg/L 6-BA诱导率高于0.5 mg/L 6-BA和 1.5 mg/L 6-BA，说明适宜的6-BA浓度有利于诱导愈伤组织。1.0 mg/L 2，4-D诱导率高于0.5 mg/L，说明要诱导愈伤组织2，4-D浓度不能过低。经极差分析可知，KT、6-BA、2，4-D的诱导率极差为11.11、8.89、15.55百分点，因此，影响愈伤组织诱导的主次关系为：2，4-D>KT>6-BA。由此可得到最优水平组合为D2E2F3，即0.4 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2，4-D。

表5 不同激素浓度对愈伤诱导率L9(34)正交试验结果

设计的9组试验中5号试验与理论最优组合吻合，故不用再做对比试验，最优组合为5号试验，即D2E2F3。

2.3 不同激素浓度对愈伤组织增殖的影响

由表6可知，1.5 mg/L KT的增殖倍数均高于1.0 mg/L KT和2.0 mg/L KT，说明KT浓度过低和过高都不利于愈伤组织增殖。1.0 mg/L 6-BA增殖倍数高于0.5 mg/L 6-BA和1.5 mg/L 6-BA，说明适宜的6-BA浓度有利于愈伤组织增殖。2.0 mg/L 2，4-D增殖倍数高于不加和加1.0 mg/L 2，4-D，说明愈伤组织增殖的2,4-D浓度不能过低。1.5 mg/L NAA增殖倍数高于0.5 mg/L和1.5 mg/L NAA，说明愈伤组织增殖NAA浓度也不能过低。经极差分析可知，KT、6-BA、2，4-D、NAA的增殖倍数极差为1.08、0.18、0.28、0.17，因此，影响愈伤组织诱导的主次关系为：KT>2，4-D>6-BA>NAA。由此可得到最优水平组合为G2H2I3J3，即：1.5 mg/L KT、1.0 mg/L 6-BA、2.0 mg/L 2，4-D、1.5 mg/L NAA。验证试验结果表明：该组合条件下的愈伤组织增殖倍数为2.92，高于设计的9组试验的增殖倍数，可以确定该组合为最优条件。

2.4 愈伤组织中双黄酮的含量

试验结果表明，愈伤组织中双黄酮在波长260 nm处有最大吸收峰，与双黄酮标准样品的吸收峰波长在60 min出峰，峰形尖锐而且没有杂峰。样品在相应的时间段内也出峰，与标准样品出峰时间基本吻合。由标准曲线、峰面积，对标样浓度计算相关系数为0.9962，相关性好。参照芸香苷标准曲线算得的双黄酮得率为15.62 mg/g。

表6 不同激素对愈伤组织增殖L9(34)正交试验结果

3 讨论与结论

由于主客观条件的局限性，对成活的外植体没有进行脱毒检测，再后期的继代增殖中容易爆发大范围的感染。对于外植体消毒试验应该对试验过程产生的各种微生物进行分离纯化，鉴定微生物的种类和分析微生物产生的原因。

在正交试验中2，4-D的浓度没有筛选出最佳浓度，在后期的试验中应对其设置多个浓度梯度进行单因素试验，筛选出2，4-D的浓度对诱导愈伤组织的最佳浓度，这样试验才更具完整性和精确性。

愈伤组织双黄酮的得率比自然条件下叶片的得率高，但与邓祥宜等的得率[21]有差别。可能与愈伤组织的生长增殖的速率和继代次数有关，也可能与双黄酮的提取条件有关。在后续的试验中应进一步研究不同时期的愈伤组织和增殖代数对双黄酮含量的影响和提取条件的优化。

用银杏愈伤组织提取双黄酮的提取率比较高[21]，而且比用银杏叶提取双黄酮提取率要高得多[22]。这样可以打破季节的束缚，也可以提高双黄酮的获得量，可以很好地满足市场需求。