陈嘉蔚，赵培静，邓锦波，李姣清，明飞平，张淑霞，卢悄佳，张玲华

（1.华南农业大学生命科学学院/广东省农业生物蛋白功能与调控重点实验室，广东 广州 510642；2.广州市微生物研究所，广东 广州 510663）

细菌通过称为群体感应（quorum sensing，QS）的机制响应细菌群体密度变化，进而调控目的基因的表达。细菌分泌一种小分子自诱导物（Autoinducer，AI），该信号物质可以通过自由扩散进入细胞壁和细胞膜，当其浓度随细菌密度增加而提高到一个临界浓度时，细菌群体就能响应信号分子表现出某些生物学功能，以适应环境变化，为种群争取更大的优势［1-2］。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是细菌群体感应系统中的关键信号分子，它在革兰氏阴性细菌群体感应系统中普遍存在，调控多种致病菌毒力因子、胞外多糖和抗生素的表达，促进生物膜形成和孢子产生，强化自身群体与其他细菌、真菌、植物和动物的生存竞争［3］。当AHLs浓度达到阈值，能激活致病基因的表达，诱发细菌性软腐病、青枯病、真菌侵染、灰霉病等疾病，严重危害经济作物［4-6］。几种土壤细菌可以通过酶降解AHLs来干扰QS，该现象被称为群体淬灭［7］。大部分芽胞杆菌可以通过自诱导物失活（Autoinducer inactivation，AiiA）蛋白水解AHLs的内酯环，从而破坏细菌的QS系统，减弱其产生的危害［8］。因此，利用AiiA蛋白降解AHLs分子来防治细菌性植物病害的研究也逐渐展开，目前AHLs的降解已被证明是控制植物细菌性感染的有效方法［9-11］。

然而，由于芽孢杆菌表达的AiiA蛋白是一种胞内蛋白，表达水平较低，也不能分泌到胞外对环境中的AHLs分子进行降解，因此目前国内外对提高AiiA蛋白的表达量及活性研究主要包括两大方向：构建外源高效分泌表达AiiA蛋白的工程菌以及将aiiA基因转化植株，但aiiA基因在转基因植物中的表达对植物生长、发育以及转基因食品对人体的影响尚不清楚，欧阳乐军等成功构建了aiiA基因的植物表达载体 pCAM-aiiA，总体而言转aiiA植物的研究相对较少［12-13］。目前，AiiA蛋白已经在原核表达系统和真核表达系统中得到了表达，如大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统［14-16］。但大肠杆菌异源性表达目的蛋白容易形成包涵体等缺点使其研究及在工农业上的应用受到一定限制。研究发现，不同表达系统的aiiA基因存在密码子偏好性差异，其中芽胞杆菌aiiA基因与毕赤酵母差异较大，如需实现aiiA基因的高效表达必须进行密码子突变或者进行全序列同义合成［17-18］。本研究从枯草芽孢杆菌中扩增胞苷脱氨酶（CDD）基因的启动子P43以及aiiA基因，采用搭桥PCR的方法将P43强启动子连接到aiiA基因上游，构建P43-aiiA-C11重组枯草芽孢杆菌，重组菌株具有良好的降解AHLs能力，对将AiiA蛋白应用于农作物病害防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌（E. coli）DH5α、根 癌 农 杆 菌（Agrobacterium tumefaciens）NTL4（pZLR4）（含traG-lacZ融合基因和traR基因，羧苄青霉素抗性，庆大霉素抗性）、根癌农杆菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR，含traI基因）由华南农业大学生命科学学院微生物实验室保存，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C11（该菌株是本实验室前期通过大量田间实验分离筛选得到的具有良好预防青枯病致病菌作用的生防菌株）；pMD20-T载体购于大连宝生物公司，pHY300PLK枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体购于TaKaRa公司。

1.1.2 工具酶及其他试剂XbaⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶、pfu高保真酶、Taq聚合酶购于TaKaRa公司；羧苄青霉素（Car）、庆大霉素（Gm）等抗生素购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.1.3 引物 根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌P43启动子序列（EF473728.1）以及aiiA基因序列（DQ000640.1），设计2对引物（Primer 1/2、Primer 3/4） ，引物由上海生工公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2 试验方法

1.2.1 PCR扩增P43启动子与aiiA基因 以本实验室从枯草芽孢杆菌总DNA中扩增得到的P43启动子和aiiA基因为模板，以Primer 1/2和Primer 3/4为引物分别进行PCR扩增。PCR反应体系：10× pfu buffer 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，引物 Primer 1/2 或 Primer 3/4（10 pmol/L）各1 μL，pfu酶0.5 μL，模板1 μL，补ddH2O至20 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min，（94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min）×30循环，72℃延伸10 min。

1.2.2 搭桥PCR连接P43启动子与aiiA基因PCR反应得到的启动子P43扩增片段3’端带有aiiA扩增片段的第1～20个碱基，aiiA基因扩增片段5’端带有P43扩增片段的15个碱基。将PCR反应得到的P43启动子与aiiA基因扩增产物纯化后混合，用Primer 1和Primer 4进行PCR扩增（具体流程见图1）。PCR反应体系：10× pfu buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL， 引 物Primer 1、Primer 4（10 pmol/L）各 2.5 μL，pfu 酶0.5 μL，P43与aiiA扩增回收产物各1 μL，补ddH2O至50 μL。PCR反应程序：94℃预变性3 min，（94℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸2 min）× 30循环，72℃延伸10 min。

图1 搭桥PCR扩增P43-aiiA

1.2.3 构建P43-aiiA-pHY300PLK重组质粒 将PCR扩增得到的P43-aiiA片段纯化回收后与pMD20-T载体连接，转化DH5α后进行菌落PCR与双酶切鉴定并提取质粒送测序，鉴定正确后利用XbaⅠ、EcoRⅠ对P43-aiiA片段和pHY300PLK载体进行双酶切，纯化回收后进行连接，并转化DH5α进行鉴定与测序，重组质粒命名为P43-aiiA-pHY300PLK（具体流程见图2）。鉴定正确后，将重组质粒转化枯草芽孢杆菌C11。

图2 P43-aiiA-pHY300PLK重组质粒的构建

1.2.4 验证AiiA酶活性 AiiA酶活性检测参照文献［19］的方法并略作改进。用根瘤农杆菌NTL4（pZLR4）作为指示菌检测长酰基链AHLs，该菌株携带含有traR和traG-lacZ融合基因的质粒pZLR4，长酰基链AHLs可诱导traR蛋白的转录，激活traG-lacZ融合基因的表达，β-半乳糖苷酶的活性可用于traG转录的报告［20-21］。根癌农杆菌 NTL4 （pTiC58ΔaccR）含有traI基因，其编码traI蛋白可以大量合成AHLs分子［22］。将根癌农杆菌NTL4（pTiC58ΔaccR）的16 h培养液离心，取上清过滤除菌，按2%接菌至过滤上清液，接野生型枯草芽孢杆菌C11作阴性对照，阳性对照用新鲜YEP培养液接待测菌，培养过夜后，离心取上清液作样品。

检测方法一：取上清液10 μL加至含X-gal的条状YEP琼脂培养基，待上清液基本被培养基吸收后，在样品下方均匀点接指示菌NTL4（pZLR4），每个0.8 μL，28℃培养24 h后观察并记录试验结果（具体操作见表2），待测样品点样处与最远的蓝色菌落的距离若小于阴性对照，表明该样品具有AiiA活性。

检测方法二：将指示菌NTL4（pZLR4）涂布至含X-gal的YEP平板，取样品上清液10 μL加至平板上，28℃培养24 h后观察试验结果，待测样品点样处蓝色菌落范围若小于阴性对照，表明该样品具有AiiA活性，范围越小则AiiA活性越高。

表2 验证AiiA活性流程

2 结果与分析

2.1 P43启动子与aiiA基因的克隆

通过PCR扩增出带酶切位点的P43启动子与aiiA基因片段大小分别应为308 bp和776 bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与预期结果相符，但P43启动子扩增产物有非特异条带（图3），对P43启动子与aiiA基因扩增产物进行切胶回收。

图3 P43启动子与aiiA基因扩增产物电泳结果

2.2 重组质粒P43-aiiA-pHY300PLK的构建

通过SOE PCR扩增得到的P43-aiiA片段应为1 069 bp，经琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与预期结果相符（图4）。

图4 P43-aiiA片段扩增产物电泳结果

将P43-aiiA片段与pMD20-T载体连接，转化DH5α后进行菌落PCR鉴定并提取质粒送测序，测序结果正确；对P43-aiiA片段和pHY300PLK质粒进行双酶切与连接，并转化DH5α进行鉴定与测序，测序结果正确。将重组质粒转化枯草芽孢杆菌C11，进行菌落PCR与双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，菌落PCR扩增条带大小与双酶切片段大小都与预期结果相符（图5），重组菌株命名为P43-aiiA-C11。

2.3 AiiA酶活验证

AiiA活性检测结果见图6A，阴性对照中指示菌NTL4（pZLR4）几乎全部变蓝，只有最下端菌落蓝色较浅；3个平行试验的指示菌至条状培养基中间蓝色开始变浅，至下端全部为白色菌落。由图6B可知，平板上试验组蓝色扩散范围（25 mm）比阴性对照（15 mm）小，而阳性对照中均为白色菌落。说明农杆菌NTL4（pTiC58ΔaccR）培养液上清中含有AHLs分子，而实验所构建的P43-aiiA-C11菌株具有高于野生型C11菌株的淬灭酶活性，能明显降解信号分子。

图6 P43-aiiA-C11菌株AiiA酶活验证

3 结论与讨论

本试验成功扩增P43启动子和aiiA基因的联合片段P43-aiiA，构建含有P43启动子和aiiA基因的穿梭载体P43-aiiA-pHY300PLK，并成功导入枯草芽孢杆菌中表达。与野生型菌株相比，构建菌株P43-aiiA-C11表达产物具有显著的降解AHLs能力，为构建防治植物病害的基因工程菌株带来了新方向，对减少农作物致病因素具有重要意义。

AiiA蛋白能够降解革兰氏阴性菌产生的信号分子AHLs，从而抑制致病菌的生长以及致病基因的表达，达到生物防治的效果。但天然AiiA蛋白的表达量较低，温真等［23］用aiiA基因的启动子代替pET-28a中的T7启动子，经荧光显微镜镜观察，发现aiiA基因的启动子强度并不是很强，较新的研究表明aiiA启动子中还包含负调控序列［24］。为了提高AiiA蛋白的表达量，吴怀光等［25］利用苏云金芽孢杆菌S-层蛋白基因与杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子与aiiA基因融合表达，得到了能高效和稳定表达AiiA蛋白的苏云金芽孢杆菌菌株。曾世涌等［26］利用枯草芽孢杆菌eglS基因的启动子与信号肽序列在枯草芽孢杆菌中表达苏云金芽孢杆菌aiiA基因，表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性。陈珺君等［27］利用野生型多黏芽胞杆菌表达苏云金芽胞杆菌aiiA基因，结果表明AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有抗病活性，但不具有抑菌活性。然而，在天然环境下，异源性表达无可避免会遇到密码子偏好性差异的问题，影响目的基因的表达。2007年Pan等［28］首次从枯草芽孢杆菌中克隆得到aiiA基因，因此本研究选用枯草芽孢杆菌C11作为表达菌株表达枯草芽孢杆菌aiiA基因，枯草芽孢杆菌表达系统具有表达量高、生长迅速、适应性强、容易培育的优点，与大肠杆菌表达系统相比，利用枯草芽孢杆菌表达的重组蛋白大多具有生物活性和维持天然结构，枯草芽孢杆菌也是目前应用较广的微生物杀菌剂之一。

本研究通过搭桥PCR扩增枯草芽孢杆菌启动子P43以及aiiA基因的联合片段，连接穿梭载体pHY300PLK转化草芽孢杆菌。P43是组成型启动子，研究发现P43启动子在枯草杆菌生长对数前期已开始表现活性，随后转录活性迅速提高，有利于AiiA蛋白在天然环境下持续性表达［29-30］。Wan等［31］通过启动子替换构建pMA0911-P43-PUL，在同等条件下测定支链淀粉酶最高酶活可提高2倍。本研究利用指示菌NTL4（pZLR4）在AHLs存在的条件下能在含有X-gal平板上长出蓝色菌落的原理，通过在条状培养基上点接指示菌和在平板上涂布指示菌，均验证P43-aiiA-C11菌株对AHLs信号分子具有明显淬灭活性。而AiiA蛋白不含信号肽［32］，研究工作将进一步提高AiiA蛋白的分泌表达，增强其在土壤环境中降解AHLs分子的效力。