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(1.四川大学华西医院超声科，2.临床超声影像药物研究室，四川 成都 610041)

目前,我国乳腺癌发病率的增长速度居全球首位，已成为城市女性最常发生的恶性肿瘤之一。超声分子显像(ultrasound molecular imaging, USMI)通过靶向超声造影剂识别病变血管内皮细胞特异性表达靶点[1]，实现在分子水平诊断疾病。靶向超声造影剂的靶点主要为炎症病灶、血栓、新生血管等部位的特定生物标记物[2-3]。新生血管在恶性肿瘤发生及转移中有重要角色，而血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)/血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR)通路是肿瘤新生血管的重要调控通路。VEGFR2是VEGF/VEGFR通路的重要因子，参与调节乳腺癌新生血管微循环渗透性及内皮细胞增殖、迁移和侵袭等[4]。本研究对VEGFR2靶向超声造影诊断乳腺癌的研究进展进行综述。

1 靶向超声造影的作用原理

超声造影由微泡振荡产生非线性声增强超声信号，通过特定脉冲序列包括谐波滤波器、脉冲反向、波幅调制等区分微泡信号与周围组织及血流信号。超声造影剂是由脂质、白蛋白或多聚物等包裹惰性气体形成的微泡[5]，直径小于10 μm，可自由通过毛细血管，且不会渗出血管，从而将不同疾病的靶向生物标记物连接于微泡表面[6]。在诊断疾病过程中，靶向超声造影剂可与血管内皮靶点特异结合，以超声信号强度的变化反映靶点分子表达水平[7-8]，进而反映局部组织微血管循环。

靶向超声造影需在超声造影产生增强超声信号的基础上进一步区分结合微泡与非结合微泡产生的声信号。目前主要通过超声靶向微泡破坏(ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)延长声信号采集时间，以区分结合微泡与非结合微泡产生的声信号，即随着采集时间延长，自由流动的非结合微泡被从目标区域清除；随后采用高机械指数破坏声场区的结合微泡，计算破坏前后靶向声信号差(differential targeted enhancement, dTE)，以dTE值表示结合微泡产生的声信号强度[9]。

2 VEGFR2靶向超声造影用于乳腺癌诊断的原理

在乳腺纤维腺瘤、导管内原位癌及浸润性乳腺癌等组织中均存在VEGFR2表达。VEGFR2表达水平变化与肿瘤病理分期、转移及预后等密切相关[10]。既往研究[11]表明，检测肿瘤新生血管内皮细胞VEGFR2表达水平可用于区分乳腺纤维腺瘤与恶性肿瘤，且诊断准确率高于αVβ3整合素及局部血管密度计数。局部血管密度计数只纳入CD31阳性血管，计数的血管数量接近具有灌注功能的血管数，即常规超声造影产生声信号的血管数，提示常规超声造影对区分浸润性乳腺癌与乳腺纤维腺瘤及导管内原位癌的应用价值较低[12]。VEGFR2靶向超声造影剂可与病灶血管内皮细胞VEGF特异结合，并滞留于血管内皮细胞，增强靶区超声回波信号。VEGF2靶向超声造影以非侵入性方法定量分析新生血管分子标记物VEGFR2表达，可从分子水平反映肿瘤新生血管增生情况[13]。

3 VEGFR2靶向超声造影诊断乳腺癌的实验研究及临床研究

3.1 细胞实验 细胞实验可直观反映VEGFR2靶向超声造影剂与单一细胞间的结合情况及特异性识别靶点能力。在VEGFR2靶向超声造影细胞实验中，主要选择人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVEC)、小鼠SVR血管肉瘤细胞等VEGFR2高表达细胞，同时选取小鼠乳腺癌4T1细胞等不表达VEGFR2的细胞作为对照，以检测靶向微泡对VEGFR2的识别能力。VEGFR2靶向超声造影剂与其高表达细胞具有良好的结合力，且结合力与VEGFR2表达水平相关[14]。Pochon等[15]发现VEGFR2靶向超声造影剂可与HUVEC结合，采用足量VEGFR2单克隆抗体对HUVEC进行预饱和，再加入VEGFR2靶向超声造影剂，结果显示造影剂与HUVEC未结合，表明VEGFR2靶向超声造影剂具有特异性识别VEGFR2的能力。Willmann等[16]采用VEGFR2及αVβ3整合素双靶点靶向超声造影剂对小鼠SVR细胞和4T1细胞进行研究，证实双靶点靶向超声造影剂可与SVR细胞特异性结合，且结合力显著高于4T1细胞；同时双靶点靶向超声造影剂与SVR细胞的结合力显著高于单靶点造影剂，提示存在VEGFR2及其他靶点的靶向超声造影剂与靶向微泡的结合力增加。

3.2 动物实验 Lee等[17]对67NR乳腺癌细胞小鼠移植瘤模型的研究表明，VEGFR2靶向超声造影剂在肿瘤内的滞留时间显著高于非靶向微泡；定量分析发现，肿瘤血管内皮细胞VEGFR2靶向超声造影剂滞留产生的声信号强度与VEGFR2表达水平具有相关性，非靶向微泡滞留产生的声信号强度低且与VEGFR2表达水平无关。Pochon等[15]在大鼠乳腺脂肪垫下种植13762 MAT B Ⅲ CRL-1666大鼠乳腺癌细胞8天后，VEGFR2靶向超声造影检查发现直径约5～8 mm的乳腺肿块。Bzyl等[18]对MCF-7人源性乳腺癌小鼠模型的研究发现，VEGFR2靶向超声造影产生的声信号dTE值可鉴别直径约2 mm的乳腺癌与正常乳腺腺体；随着肿瘤体积的增加，VEGFR2靶向超声造影产生的声信号强度下降，但仍较非靶向微泡声信号强度高；VEGFR2免疫组织化学结果证实随着肿瘤体积增大，VEGFR2表达水平下降，考虑可能与肿瘤成熟血管增多相关。Warram等[19]对人乳腺癌MDA-MB-231细胞小鼠移植瘤模型的研究发现，三靶点靶向超声造影剂产生的声信号强度高于双靶点及单靶点造影剂；提示联合使用多种针对肿瘤新生血管内皮细胞的特异性靶向标记物，能够增加靶向超声造影剂在肿瘤新生血管内皮细胞产生的声信号强度，进一步提高诊断准确性。

抗血管生成是治疗乳腺癌的重要手段，但其疗效存在较大个体差异。VEGFR2靶向超声造影作为一种早期监测VEGFR2表达水平的无创方法，可通过观察血管生成情况反映抗血管生成治疗效果，亦可通过评估VEGFR2表达程度评价不同抗血管生成药物对VEGFR2靶点的作用效果，有助于为乳腺癌制定个体化临床治疗方案。Zafarnia等[20]对小鼠MCF-7乳腺癌模型的研究表明，癌细胞对尼罗替尼(抑制血管成熟)治疗可出现短暂应答，但随后肿瘤体积增大、dTE值增加，VEGFR2表达水平升高，导致疾病进展；提示VEGFR2靶向超声造影可用于评估尼罗替尼抗血管治疗效果，可能为阐明尼罗替尼耐药机制提供依据。

4 VEGFR2靶向超声造影诊断乳腺癌的临床研究

生物素-亲和素连接法是制备靶向超声造影剂最具代表性的方法，但人体易对亲和素产生严重的免疫反应。BR55是获批应用于临床的磷脂类VEGFR2靶向超声造影剂，其使用多聚短肽作为连接体，避免了亲和素导致的免疫反应。目前已完成的BR55Ⅱ期临床试验[21]结果显示，93%乳腺癌患者VEGFR2表达水平与dTE值具有一致性，乳腺癌区域超声滞留声信号强度为周围正常乳腺组织的8倍，且患者均未出现严重不良反应。

5 问题与展望

研究靶向超声造影有利于无创分子诊断技术的发展，并能提高乳腺肿瘤超声诊断准确率。虽然VEGFR2靶向超声造影对于乳腺癌诊断及预后评估的研究已取得初步进展，但该技术仍需改进和完善：①规范定量分析标准，比较不同研究结果之间的一致性；②提高VEGFR2靶向微泡在体内循环的时间及稳定性，增加微泡延迟成像信号强度；③增加微泡与目标靶点的结合力，微泡与肿瘤的多靶点结合以增加靶向微泡的特异性；④探索其对乳腺癌淋巴结转移的诊断价值。

VEGFR2靶向超声造影时，需对超声造影图像进行定量分析，以区分表达VEGFR2的良性和恶性肿瘤，包括计算各种灌注参数和阈值等。VEGFR2靶向超声造影用于诊断乳腺癌或疗效评估时，可考虑将其与3D成像、超声探头自动扫描成像及计算机辅助检测等技术相结合，以减少对操作者的依赖性，提高诊断准确性和临床可操作性。此外，保证VEGFR2靶向超声造影图像与免疫组化分析方面的一致性，也是推动其走向临床的关键。