李向敏，樊再雯

0 引言

在我国，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤发病率和死亡率的首位。2015年我国肺癌新发病例约73.33万例，死亡约61.02万例[1]。不幸的是约60%的患者诊断时已经处于中晚期阶段，失去手术治疗的机会。这部分患者可选择的治疗方式只有化疗、放疗、靶向治疗。据报道，非小细胞肺癌5年生存率仅为17%，中晚期的NSCLC5年生存率不足5%[2]，肺癌已然成为我国癌症患者最具威胁的杀手。随着对免疫检查点不断深入的研究，越来越多的免疫检查点被发现，包括：细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4）、程序性死亡分子1（programmed death-1, PD-1）/程序性死亡分子配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）、淋巴细胞活化蛋白3（lymphocyte activation protein-3, LAG-3）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer-cell immunoglobulin-like receptor KIR）等。其中研究较为透彻的免疫检查点是CTLA-4和PD-1/PD-L1。肿瘤的发生发展取决于肿瘤细胞和机体免疫系统之间的平衡关系，当机体免疫系统不足以清除并杀伤肿瘤细胞时，肿瘤细胞就会发生免疫逃逸，肿瘤得以形成。在清除肿瘤细胞的过程中发挥最核心作用的是活化的T淋巴细胞。T淋巴细胞的活化需要抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）提呈肿瘤特异性抗原，而免疫检查点通路对T细胞识别肿瘤特异性抗原发挥关键作用。近年来免疫检查点抑制剂药物呈井喷式问世并用于临床。目前美国食品与药品管理局（Food and Drug Administration, FDA)已批准多个免疫检查点抑制剂上市：抗PD-1抗体（Nivolumab、Pembrolizumab）、抗PD-L1抗体（Atezolizumab、Duravulumab、Avelumab）、抗CTLA-4抗体Ipilimumab。另外还有许多处于临床研究阶段的免疫检查点抑制剂，如抗CTLA-4抗体Tremelimumab。也有众多我国自主研发免疫检查点抑制剂，如信迪单抗（Sintilimab,IBI308, PD-1单抗信达生物制药）、替雷利珠单抗（Tislelizumab, BGB-A317, PD-1单抗，百济神州）、卡瑞利珠单抗（Camrelizumab, SHR-1210,PD-1单抗，恒瑞）。从现有的临床研究结果看，接受免疫检查点抑制剂治疗的患者，无论是一线或二线应用，单药应答率均仅在20%左右。其应答率偏低可能的原因是没有理想的疗效预测标志物以富集免疫治疗发挥更大的抗肿瘤作用。本文就免疫检查点抑制剂在NSCLC治疗中出现的问题和不足之处进行综述。

1 免疫检查点信号通路

就目前现有的研究来看，PD-1/PD-L1、CTLA-4是研究最为透彻的免疫检查点[3]，两者在免疫调节中均发挥免疫抑制作用。CTLA-4作用于T细胞活化的初期，PD-1/PD-L1则作用于T细胞活化的晚期阶段。

1.1 CTLA-4免疫检查点

CTLA-4隶属于免疫球蛋白超家族成员，主要表达在活化的T细胞、B细胞表面，它是一种跨膜蛋白[4]。人CTLA-4基因位于2q33，包括3个外显子，外显子1编码CTLA-4的胞外区部分，这部分区域是抗原提呈细胞（antigen presenting cells,APC）上B7分子的受体；外显子2编码跨膜区；胞内区由外显子3编码[5]，胞内区包含有免疫受体酪氨酸抑制基序（immune tyrosine inhibitory motif,ITIM），这一结构与免疫受体酪氨酸刺激基序（immune tyrosine activating motif, ITAM）功能相反，ITAM存在于T细胞上CD28的胞内区。

T细胞的活化是一个复杂的过程，这一过程中既包括共刺激分子又包括共抑制分子。目前已发现两种信号刺激是T细胞活化的关键：第一信号为特异性抗原与组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）结合后形成的复合物与T细胞受体（T cell receptor, TCR）特异性结合，这一过程即为T细胞识别抗原的过程；第二信号是由表达于T细胞表面的协同刺激分子（如CD28）与APC共同产生。T细胞自开始被活化，机体为避免过强的免疫反应，免疫共抑制分子便会参与T细胞的活化过程，以类似踩刹车样的作用负性调节T细胞的功能。CTLA-4抑制T细胞活化的机制多数被认为是表达于T细胞表面的CTLA-4与CD28有极高的同源性，其中CD28与APC表面的B7分子特异性结合刺激T细胞活化，而CTLA-4与B7结合则传递抑制性信号，并且CTLA-4与B7之间的亲和力远远超过CD28与B7之间的亲和力。这样一来，CTLA-4与CD28竞争性结合B7分子，阻断了CD28中ITAM刺激T细胞活化的作用，因而达到抑制T细胞增殖活化的作用[6]。CTLA-4所产生免疫抑制可能还有很多其他机制，需要更加深入的研究来阐释。

1.2 PD-1/PD-L1免疫检查点

PD-1属于免疫球蛋白B7-CD28家族，与CTLA-4相似，也是一种跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区组成，其胞内区有ITIM、免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM）[7]。PD-1属于诱导性表达的蛋白，主要表达在活化的T细胞表面（未被激活的T细胞不表达PD-1）。PD-1也在肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes TILS）、B细胞、单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞中表达。其配体有程序性死亡因子配体1（programmed death-ligand1,PD-L1）和程序性死亡因子配体2（programmed death-ligand2, PD-L2）。PD-L1为主要配体，PD-L1即CD274、B7-H1。PD-L1主要诱导性表达在恶性肿瘤细胞表面[8]。PD-1与PD-L1结合后，PD-1胞内区的ITSM发生磷酸化，募集蛋白酪氨酸磷酸酶同源蛋白2，使得下游磷脂酰肌醇3和脾酪氨酸激酶去磷酸化，传递负性调节信号，抑制细胞因子的产生及淋巴细胞的增殖与活化[9]。生理情况下，免疫检查点可通过调节免疫反应的强度、持续时间、防止T细胞过度活化等维持机体自身免疫耐受。而TILs及活化的T淋巴细胞表面的PD-1与肿瘤细胞上的PD-L1特异性结合，负性调节T细胞活化，同时IL-10、INF-γ产生减少，造成肿瘤局部微环境中的效应T细胞明显减少，甚至匮乏，从而使肿瘤发生免疫逃逸[10]。有研究报道约60%左右的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）组织中有PD-L1的表达。肺癌组织中PD-L1的高表达往往有T细胞高度的浸润，这种状态强烈抑制了效应T细胞的活化，使T细胞以抑制的状态禁锢于免疫微环境中，不能发挥抗肿瘤作用[11]。从对立面分析，这种高度集聚的抑制性T细胞一旦被诱导活化，肿瘤局部微环境中效应T细胞也是一种富集状态，更好发挥抗肿瘤效应的同时也在一定程度上减少免疫相关不良反应（immune related adverse reactions, irAEs）。PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂通过阻断PD-1和PD-L1的结合，解除T细胞的免疫抑制，恢复T细胞清除肿瘤作用而达到抗肿瘤的目的。

2 PD-L1检测临床实践面临的困惑和挑战

免疫检查点抑制剂的出现丰富了恶性肿瘤患者的治疗选择，晚期NSCLC患者接受免疫检查点抑制剂治疗总体的有效率有限，并不是所有的NSCLC患者都适合免疫治疗。因此，要提高免疫检查点抑制剂对NSCLC患者的疗效，精准筛选获益人群至关重要。目前PD-L1被认为是比较理想的疗效预测标志物。一项Meta分析显示PD-L1的检测对于NSCLC免疫治疗的获益人群筛选的重要性[12]。多种肿瘤表达PD-L1，包括NSCLC、黑色素瘤、胃癌、乳腺癌等。肿瘤细胞表达PD-L1的机制有两种：第一，致癌基因信号通路改变引起的PD-L1的组成性表达，这种表达相对恒定；第二，在免疫细胞分泌的促炎症因子如IFN-γ的作用下引起的适应性聚焦表达，这种PD-L1的表达随着肿瘤微环境的变化而变化。两种表达机制不排斥，PD-L1的固有表达可在炎症因子作用下表达上调[13]。PD-L1的表达受多方面因素的影响，不同肿瘤或组织学类型PD-L1表达水平不同[14]。PD-L1在疾病不同时期表达也不同，并且PD-L1的表达可随治疗而变化，这主要是因化疗、放疗等治疗方式改变了肿瘤微环境。有研究表明患者的吸烟状态会影响PD-L1的表达，有吸烟史的NSCLC患者PD-L1的表达高于不吸烟的患者[15]；肿瘤的异质性可能会造成原发灶与转移灶、肿瘤组织与癌旁组织中PD-L1表达的差异；组织标本质量影响PD-L1检测结果。不同肿瘤PD-L1表达与疗效的关系不一致，部分PD-L1阴性患者接受免疫检查点抑制剂治疗有效，而部分PD-L1阳性甚至强阳性的NSCLC患者接受免疫检查点抑制剂却无效。由此得出，PD-L1是不完美的生物标志物，在临床应用中面临诸多问题。

不同PD-1/PD-L1抑制剂对于PD-L1检测要求不同，如Pembrolizumab用于晚期NSCLC患者的一线治疗要求PD-L1检测应作为伴随诊断，即PD-L1检测是必须的。PD-L1的检测在某些情况下可作为补充诊断，即对于接受相应药物治疗不是必须的检测，但PD-L1检测可以提供治疗相关的信息，如CheckMate 057入组非鳞状细胞NSCLC患者，按PD-L1表达分层分析发现PD-L1表达越高，非鳞癌患者从Nivolumab二线治疗中获益越多[16]，这是PD-L1作为补充诊断的证据。2016年ESMO大会上公布OAK研究亚组分析结果：NSCLC患者（鳞癌和非鳞癌）从Atezolizumab二线治疗中获益均随PD-L1表达增高而增加，其中PD-L1的检测是补充诊断。另外CheckMate 017关于鳞癌的研究，将Nivolumab二线用于鳞状NSCLC患者，发现无论PD-L1表达与否，鳞癌患者均能从Nivolumab二线治疗中获益，从中我们又得出无需检测PD-L1的证据[17]。鳞癌因具有更强的免疫原型，则鳞癌患者，可能是免疫检查点抑制剂治疗的优势人群[18]。作为临床医师，我们应该深入了解针对NSCLC的免疫治疗，PD-L1检测应该是伴随诊断或补充诊断。另外PD-L1检测面临的问题还包括检测抗体多种多样、检测平台的参差不齐、不同的阈值标准、缺乏标准的报告规范、PD-L1判读中主观性部分导致PD-L1的检测可靠性下降，截止目前尚缺乏标准的PD-L1的检测方法。所以PD-L1作为疗效预测标志物对筛选获益人群、提高免疫治疗疗效有一定意义，但也存在诸多不足和困惑。

为富集免疫检查点抑制剂获益人群，我们需要不断探索新的生物标志物。肿瘤突变负荷（tumor mutation burder, TMB）就是一个正在探索中的生物标志物。随着肿瘤生长，体细胞突变不断累积，而胚系DNA中不存在这些突变[19]。TMB即肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变数量[20]。体细胞突变可以在RNA/蛋白质水平表达，形成新抗原（或新表位），蛋白质/肽段被免疫系统识别为“非己”。新抗原识别促进T细胞活化，克隆扩增并分化为效应和记忆T细胞。体细胞突变随时间推移获得的突变不同于可遗传的胚系突变[21]。体细胞突变负荷可能受不同的机制影响，如吸烟[15]、紫外线照射、DNA错配修复突变等。某些肿瘤类型突变率及TMB更高，如肺癌，其他还包括黑色素瘤、膀胱癌及肠道肿瘤[22]。肿瘤TMB越强，新抗原产生可能更多，肿瘤免疫原性越强，肿瘤免疫原性越强，使T细胞反应和抗肿瘤反应越强，越适合免疫检查点抑制剂治疗[23]。研究证明PD-1/PD-L1抑制剂在各瘤种的疗效均与TMB成正相关[24]。2018年美国癌症研究协会（American Association for Cancer Research, AACR）大会上公布Checkmate 227研究：高TMB（≥10 mut/Mb）的NSCLC患者，无论PD-L1表达如何，Nivolumab+IPilimumab的PFS优于化疗，并且高TMB与高PD-L1表达不是同一人群。在Keynote026研究以PD-L1为分层依据时得到阴性试验结果时，研究人员回顾性以TMB作为分层依据，得出阳性的试验结果，说明TMB可以作为Nivolumab的良好的生物标志物。有研究显示高TMB低瘤内异质性（intratumoral heterogeneity,ITH）的NSCLC患者有更优的疗效[25]。TMB作为生物标志物的优势有：可在多种肿瘤类型中进行评估、可识别特殊突变类型并推断新抗原负荷、高覆盖率能够检测罕见体细胞突变。高通量分析也可以提供已知驱动突变信息（例如：EGFR、ALK等），可以对TMB进行定量检测，可以识别更有可能从免疫治疗中获益的患者[26]。但TMB作为生物标志物的不足也有很多，如TMB分析比较费时、价格昂贵、NGS技术复杂，需要专门的流程管理。TMB是新型生物标志物，其标准阈值尚无明确定义[27]。

免疫肿瘤生物标志物在探索中前行，正在研究中的能更好预测免疫治疗潜在应答率的肿瘤免疫生物标志物包括免疫抑制性细胞如Tregs，宿主本身环境等，这些因素都会影响免疫检查点抗肿瘤的应答。综上所述，免疫生物标志物反映的是肿瘤微环境中的免疫应答情况，不同于基于基因突变的分子生物标志物（如EGFR，ALK等）。PD-L1是目前临床实践较多的生物标志物，但本身的局限包括了PD-L1阴性表达也可获益、表达随治疗的不同动态变化以及目前检测平台多、缺乏标准化等，不是完美的免疫生物标志物。TMB可以反映肿瘤免疫原性，有望成为更好的生物标志物，但以TMB为代表的免疫预测标志物仍需要更多的探索。各种疗效预测标志物都有美中不足之处，目前把可能的标志物综合起来筛选获益人群，或许对提高免疫检查点抑制剂疗效至关重要。

3 免疫检查点抑制剂耐药的原因

约60%的患者在抗PD-1/PD-L1治疗时出现原发性耐药，有效的患者也会和接受靶向治疗的NSCLC患者一样出现继发性耐药。免疫检查点抑制剂发挥作用包括多个复杂环节，每个环节对免疫疗效都有影响。目前关于免疫检查点抑制剂可能的耐药机制有以下几方面：第一，从免疫检查点治疗的机制上讲，效应T细胞的活化取决于所处的肿瘤局部免疫微环境，最重要的是：首先，癌细胞的周围有能够识别癌细胞的免疫细胞，这样在解除免疫抑制后，这些可识别的免疫细胞才可以有效发挥抗肿瘤作用，即热肿瘤。若为冷肿瘤，因其本身免疫微环境中的免疫抵抗程度低，并且本身肿瘤的免疫原性也低于热肿瘤，会出现在解除免疫抑制后无免疫细胞来杀伤肿瘤的尴尬局面[28]；第二，肿瘤的TMB值，研究证实肿瘤的突变负荷低以及肿瘤的免疫原性差会影响效应T细胞的发育成熟，影响T细胞的活化，导致耐药的发生[29]；第三，效应T细胞活化与APCs关系密切，抗原提呈细胞，比如树突状细胞，通过摄取肿瘤抗原，并提呈给效应T细胞，这一过程强有力地诱导和活化了肿瘤抗原特异性效应T细胞，从而介导抗肿瘤效应，扰乱这一过程中的任何一个环节都有可能导致免疫耐药的发生，如树突状细胞的缺失；第四，人体内发挥免疫抑制的通路有很多，除了PD-1/PD-L1信号通路、CTLA-4信号通路以外，还有TIM3、LAG3等，假设这些免疫抑制性通路共存于肿瘤组织中，若仅阻断其中一条免疫抑制通路，其他的免疫抑制性通路仍正常转导，甚至代偿性增强，免疫治疗也不会取得理想疗效[30]。引起免疫耐药的原因可能还有很多，需要更多的研究去探索。找到对抗免疫耐药方法，扩大免疫检查点抑制剂的有效率才是最终目的。

4 免疫治疗中的特殊现象

传统肿瘤治疗方法直接杀伤肿瘤细胞，而免疫检查点抑制剂是通过利用机体自身的免疫系统杀伤肿瘤[31]。免疫检查点抑制剂发挥抗肿瘤作用相对缓慢，并且抗肿瘤免疫应答通过持续识别和记忆肿瘤抗原，随时间不断增强和扩大。而免疫记忆则是持久应答的另一机制，随着免疫应答的扩大，一些细胞毒性T细胞分化为成熟记忆T细胞，即使在原始抗原刺激不存在时，这些细胞依然能够提供长期免疫记忆保护[32]。基于持久应答作用特点，免疫治疗给肿瘤患者带来长期获益。免疫检查点抑制剂治疗过程中有一小部分患者会出现假性进展现象，假性进展是在肿瘤负荷在影像学表现增大时，患者仍可以获益从而达到客观缓解或疾病稳定。这是免疫治疗独特的应答方式，假性进展的机制系免疫检查点抑制剂解除免疫抑制后，效应T细胞增殖，浸润于肿瘤组织周围，肿块可能表现为增大或者新病灶出现。因为效应T细胞不断恢复抗肿瘤活性，达到适应性免疫反应需要一定时间，假性进展可能表现为肿瘤持续增长直至达到一定程度才会缓解。假性进展的患者症状体征等稳定，区别于病情进展的患者。对增大或新发病灶进行活检，同时对患者进行严密的影像学监测发现假性进展病理检查多见浸润性T淋巴细胞，而疾病进展为肿瘤细胞[33]。假性进展也可用ctDNA和IL-8来动态监测[34]。除了发生假性进展外，免疫检查点抑制剂治疗还可出现超进展现象。超进展又称快速进展，这种现象在分子靶向治疗中也报道过[35]。超进展与年龄高度相关，多发生在年龄较大的患者，具体机制尚不清楚。另外有报道MDM2基因扩增的患者，在接受免疫检查点抑制剂治疗后更易发生超进展[36]。在免疫检查点抑制剂的临床实践中，临床医师要及时准确鉴别、认识上述现象，减少超进展发生，提高患者生活质量，延长患者生存期。

5 小结与展望

免疫检查点抑制剂已经改变了晚期NSCLC的治疗格局，在NSCLC患者的一二线甚至多线治疗中均表现出优势，但仍有许多问题亟待解决：如探索需要比PD-L1和TMB更准确的生物标志物预测获益人群，使免疫检查点抑制剂的治疗更加精准化；免疫治疗有起效缓慢、持续应答以及“假性进展”现象等特点，应用传统的RECIST评估疗效显然不合适，需要制定新的疗效评价标准评估免疫治疗的有效性。如何选择免疫检查点抑制剂的用药时机，以及何时停止免疫治疗可以达到经济学和疗效的最佳截点，这些都值得进一步探索。肿瘤免疫检查点抑制剂治疗可谓是目前研究者的焦点，新的药物及相应的临床研究不断出现，相信不久的将来，肿瘤的免疫治疗一定会使得更多的恶性肿瘤患者获益，甚至攻克肿瘤这一世界难题。