鲤疱疹病毒（CyHV-3）及抗病选育研究现状与进展

2019-01-05孙佳鑫石连玉贾智英

水产学杂志 2019年6期

孙佳鑫，石连玉，贾智英

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

鲤疱疹病毒（CyHV-3）病是由锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus,KHV）引起的鲤Cyprinus carpio和锦鲤传染并致死性病毒病。锦鲤疱疹病毒又称鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3），也有文献称为鲤间质性肾炎及鳃坏死病毒（Carp interstitial nephritis and gill necrosis virus,CNGV）。KHV主要感染锦鲤和普通鲤及其变种，死亡率高达75%～95%[1]，是威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种病毒性疾病，引起了世界动物卫生组织（OIE）的高度重视，于2006 年将锦鲤疱疹病毒病（KHVD）列为必须报告的疾病[2]。2001 年该疾病在香港首次爆发，被中国农业部列在《一、二、三类动物疫病病种名录》中的二类疫病[3]。

1 病原学

鲤疱疹病毒Ⅲ型（CyHV-3）与CyHV-1 和Cy-HV-2 同属于疱疹病毒目中的疱疹病毒科[4]。2009年国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）将该病毒列入疱疹病毒目Herpesvirales、异疱疹病毒科Alloherpesviridae、鲤疱疹病毒属Cyprini-virus[5]。鲤疱疹病毒是双链DNA病毒，基因组全长295kb，包含两端22 个正向重读序列，G 碱基和C 碱基含量比例为59.2%。基因组共编码164 个开放阅读框（ORF），包含其中8 个末端重复ORF，是基因组最大的疱疹病毒[6]。

2 流行病学特征

2.1 研究历史和地理分布

1996 年，英国的野生鲤中曾发现过鲤疱疹病毒，但没有公开报道。1997 年德国首次正式报道[7]。1998 年美国科学家在以色列爆发的锦鲤病鱼中分离鉴定出了该病的病原为鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Diease,KHVD）。2001 年，鲤疱疹病毒在香港首次爆发，次年入侵中国台湾以及广东地区，但是，当时并没有引起重视，造成了大批量鲤、锦鲤死亡，死亡率高达80%～100%[8,9]。2002 年，该病毒在印度尼西亚暴发，损失高达上百万美元。2003 年，仅一个月内，日本鲤和锦鲤的死亡量就达1 125t[9]。

目前，鲤疱疹病毒已经蔓延到鲤主养区，据不完全统计，已有30 多个国家报道过鲤疱疹病毒病。锦鲤和鲤的观赏价值及经济价值极高，鲤间国际贸易和交流是该病毒快速传播的主要原因，而该病的爆发不仅对鱼类养殖业造成了不小的冲击，也对中国水生动物进出口贸易带来较大经济损失和政治影响。

2.2 病毒宿主

鲤疱疹病毒具有高度传染性和极强的毒性，其宿主可为锦鲤、鲤及其普通变种，但感染却仅限于鲤、锦鲤[8]。鳞片是鱼体的第一道屏障，鳞片极少的镜鲤比全鳞的鲤更易感染病毒[7]。而与鲤种系相近的金鱼Carassius auratus 和异育银鲫Carassius auratus gibelio，则有可能成为潜在的病毒携带者[10]。对病毒生活环境的研究表明：水体的沉积物和水生脊椎动物也是持续携带鲤疱疹病毒的宿主之一[7]。各阶段的鱼体，像鱼苗、幼鱼、成鱼都可能感染鲤疱疹病毒，关于易染病阶段，目前有两种截然相反的说法。一种认为：幼鱼比成鱼更易感染病毒，因为幼鱼的免疫系统不健全，对病毒的抵抗力和免疫力比较低[7]。而另一种说法是：群集、繁殖可能会加剧病毒的传播，所以性成熟期的鱼比鱼苗更易感染[11]。但是，Mccoll 等[12]发现，感染该病毒后，体长小于2.0cm 的幼鱼不死亡。

2.3 病毒生长环境

鲤疱疹病毒在水体中生存、繁殖和传播，而鱼类的分泌物为病毒提供了营养和更适宜生长的环境，所以病毒在鱼体上可存活4h 左右。当温度限制病毒存活时，鲤疱疹病毒在鱼体内以一种潜伏状态持续存活。当鱼体转入适合温度时，病毒再次恢复活力[13]。虽然鲤疱疹病毒的适应能力很强，但是对酸碱性的抗性较弱，当pH＜3 和＞11 时，鲤疱疹病毒不能生存[14]。

鲤疱疹病毒最适合的生存水温在18～30℃之间，与鱼类的生存环境非常接近，鱼类很容易感染，很难通过调节水温来控制病毒的生存和传播。当病毒处于适宜温度时，鱼群会大规模发病、死亡，幸存的鱼成为疾病的传播者；当温度不适宜时，鱼类会感染病毒，但不发病。

2.4 传播方式和流行季节

鲤疱疹病毒主要通过鱼类的粪便、尿液、鳃和皮肤粘液进行传播，当病毒扩散时，鱼会被水里、土壤里的病毒感染，接触病鱼也会被感染[15]。鲤疱疹病毒病发病的最适温度为23～25℃，潜伏期约14d。发病主要集中在春末夏初和初秋两季传染，水温在30℃以上或者10℃以下都不适宜病毒生存，病毒进入休眠状态，不复制或病毒量很低[10]，即使有鱼患病，依靠自身的免疫力也可自行治愈。

Miwa 等[16]研究了鲤疱疹病毒Ⅲ的发病机制，发现在第5～8d 取样的鱼中，皮肤表皮受损最严重，引起的渗透性休克是急性死亡的直接原因。而感染病毒一年后，鲤中枢神经系统中发现了大量的病毒，病毒可持续感染中枢神经系统，形成潜伏期。

2.5 发病症状

鲤疱疹病毒使鲤发生间质性肾炎、鳃坏死[17]。检测病鱼脑、眼、鳃、脾、肾、肝和肠内容物等时发现了鲤疱疹病毒。不同感染期病鱼的症状不同[18]。感染初期，鱼体游动缓慢、打转，体表出现白斑，少量出血；鱼眼凹陷，眼底出血，类似寄生虫感染和细菌感染；鳞片松动随后脱落并带有红血丝；皮下组织和肌肉出血；肛门红肿；鳍条充血，尾鳍最严重，臀鳍和背鳍次之；鳃丝深红色，剪去全鳃，流血量减少且迅速凝固；肠道充血发红且硬挺，肾肿大发红，脾脏有出血点，胆汁颜色较深[19]。

感染中后期，病鱼萎靡、行为反常、食欲下降；漂浮在水面，不能主动游泳；撕开皮肤可看见明显的红血丝，伴有苍白块斑与水泡，体表局部溃疡，分泌大量黏液[20]，患病鱼在1～2d 后开始死亡，2～4d 后死亡率可达80%～100%。发病时具有发病急、感染率高和死亡率高等特点。鲤疱疹病毒可通过皮肤和牙周咽粘膜感染进入鱼体[21]。但是，有研究发现，清除皮肤粘液或者表皮损伤后，加剧病毒侵入鱼体，这说明皮肤粘液具有先天免疫功能，可阻止病毒从表皮进入[22]。

3 检测方法

3.1 分子生物学检测技术

3.1.1 荧光定量PCR 检测

聚合酶链式反应（PCR）操作方便、迅速、检测灵敏度高，可精准检测鲤疱疹病毒病感染，是检测病毒最常用的方法之一。在定性PCR 技术中加入荧光集团，发展出了荧光定量PCR 技术，通过实时检测产物中的荧光信号强度来定量。荧光定量PCR 具有灵敏性高、特异性高和精确性高的优点。PCR 检测技术可检验出病鱼体内鲤疱疹病毒呈阳性，但是对潜伏感染的鱼类病毒携带者，即外表健康的鱼，则无法轻易检测出是否感染了病毒[23]。

数字PCR 精确、灵敏，实现了单分子DNA 的绝对定量，是DNA 定量检测的新技术。Mie 等[24]利用数字PCR 技术从湖泊和池塘沉积物中提取Cy-HV-3，定量比较了沉积物和水体中CyHV-3 的丰度，说明沉积物可成为自然淡水环境中CyHV-3 的储集层。

3.1.2 LAMP 检测

环介导等温扩增（LAMP）是一种新式恒温核酸扩增方法，更简便快速、准确、廉价、易检测，可目视直接读取。LAMP 经一系列改良后，逐渐将免疫捕获与直接绑定技术和核算测流分析技术应用于LAMP方法中，使LAMP 方法的敏感度和特异性越来越高，降低了交叉污染的风险[25]，可能成为快速检测鲤疱疹病毒的有力工具。LAMP 检测法因为不需要热循环仪，适合在发病现场检测，目前已经研发出相关试纸条，虽然成本较高，但LAMP 方法具有良好的应用前景。

3.2 免疫学检测技术

免疫学检测（ELISA）是一种间接诊断方法，也是常见的病原或抗体检测方法。这种检测方法依赖抗原抗体特异性结合，通过免疫组织化学和免疫荧光测定方法，分别在感染鱼的组织器官和触摸印迹中，检测锦鲤和鲤血清中的特异性抗体[29]。因为不易检测出鱼类血清中的低水平抗体，所以ELISA 的应用受到了一定的限制[18]。

3.3 电镜观察

电子显微镜技术是研究病毒形态学不可或缺的工具，在病原确诊过程中常作为重要的辅助手段，能观察患病组织中病毒的形态和大小。在首次进行鲤疱疹病毒分离时，应用的就是电镜技术进行辅助诊断，在鳃上细胞中观察到了鲤疱疹病毒的核衣壳[26]。用电镜技术研究鲤疱疹病毒的超微结构[27]，详细描述其形态学[28]的研究很多。

3.4 其他方法

除了以上方法以外，还有原位杂交技术、免疫印迹荧光分析、基因芯片多重检测等。原位杂交技术是从细胞水平对病毒进行检测，其敏感度和准确度高，应用广泛，但是，设备仪器非常昂贵，不适宜推广应用。多样的检测方法可以增加疾病防控的新思路，为未来的疾病防控提供了更多的可能性。

4 抗病性状选育

4.1 抗病性状遗传基础

开展鲤抗病遗传改良工作的基础是找到群体或个体间的抗病变异，提高育种对象对某种疾病易感性的遗传变异是育种工作的基础。degrd 等[30]研究了4 个鲤群体（Szarvas 群体、Armur 群体、Duna 群体和Tana 群体）对疱疹病毒的抗性，发现这4 个群体感染疱疹病毒后，存活率差异显著，分别为0%、11%、12%和21%。利用这4 个群体建立了92 个家系，计算了相关抗病遗传力，其中对疱疹病毒的抗病力高达0.79。养殖鲤遗传变异低于野生鲤，鲤养殖品系与野生群体间也存在明显的遗传抗病差异[31]。影响鲤抗病力的主要因素是遗传，不同群体或品系的鲤抗病性能存在明显的遗传差异[32]。黑龙江水产研究所分析了我国北方网箱养殖中爆发性死亡的德国镜鲤的死亡个体和存活个体分子样品的遗传结构，发现死亡和存活的德国镜鲤个体的遗传性不同，而这种差异可能导致二者抗病性能的不同[33]。

4.2 鲤疱疹病毒抗病机制

Neave 等[34]对鲤前肾进行了转录组分析，研究了免疫球蛋白和同系物的功能差异，对感染鲤疱疹病毒的鲤进行转录组测序，检测两种宿主的基因表达得到的结论是：在鲤疱疹病毒急性感染过程中，鲤基因组中不同感染阶段的许多免疫相关基因被相继表达。这表明适应性免疫反应在抗病过程中起重要作用。Lee 等[35]对感染鲤疱疹病毒Ⅲ（CyHV3）的鲤脑脾组织进行转录分析，用高通量测序技术在转录组水平分析差异表达基因（DEGs）。对DEGs 的KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析显示，总共有12 002 个DEG unigenes 被注释到256 个通路，这些通路分为6 大类。实时荧光定量PCR 验证了20 个差异表达基因。

4.3 抗病相关标记的筛选

随着分子生物学技术的进步和基因组资源的开发，开发了大量性状相关的标记，分子标记辅助技术也得以应用，分子辅助育种在抗病性状选育中起到了举足轻重的作用。如在牙鲆Paralichthys olivaceus抗淋巴囊肿品种选育过程中，分子标记发挥了重要的辅助作用，将培育的100 多万尾抗病牙鲆鱼种养殖在27 个养殖场，发病率几乎为零[36]。在鲤抗疱疹病毒中也进行了抗病相关标记的开发和相关辅助育种工作。Rakus 等[37]研究了疱疹病毒的抗性之间的关系，实验中，8～12d 时，感染疱疹病毒的鱼死亡率高达79.9%。PCR-RF-SSCP 分析发现：主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）classⅡB 一种基因型与疱疹病毒的抗药性有关。Pawapol 等[38]研究了14 个基因的23 个SNP 位点与疱疹病毒抗病的相关性，认为zIL-10a 基因具有GCG 杂合或纯合基因型，对疱疹病毒均易感。Jia 等[39]也对MHC 进行了抗病相关性的研究，在MHC classⅠ和classⅡ中筛选到2 个相关位点，成功指导了抗疱疹病毒镜鲤新品种的选育。

4.4 抗疱疹病毒品种选育的研究进展

群体选育和家系选育方法较为成熟，被广泛运用到鱼类的抗病育种中[31]。群体选育一般适合选育性状可控制的基因数较少时，而家系选育则用于性状可控制的基因数较多，或者遗传力较低时。随着生物技术的快速发展，分子辅助育种技术在鱼类抗病育种中也得到了广泛应用[32]。

中国水产科学研究院黑龙江水产研究所采取了群体选育、家系选育和分子辅助育种相结合的方法，选育抗疱疹病毒的镜鲤，目前已选育到F3代，F1、F2和F3成活率分别为61.1%、88.6%和92.5%[40]，不同选育世代抗病性能及显著性分析表明，F2、F3与F1成活率差异显著，而F2、F3间差异不显著，说明F3抗病性状趋于稳定。白珊珊等[40]利用荧光定量PCR 技术比较了F1、F2、F3世代选育免疫基因表达以及鲤疱疹病毒的病毒载量。结果表明：在F1、F2和F3当中，鲤疱疹病毒的病毒载量逐渐下降，说明随着选育的进行和抗病性能的提高，病毒载量逐渐降低。