祁银燕，邓 磊，郝广婧，朱春云

(1 青海大学 农林科学院, 西宁 810016；2 青海省农林科学院，西宁 810016；3 青海大学 三江源生态与高原农牧业国家重点实验室, 西宁 810016；4 青海省高原林木遗传育种重点实验室，西宁 810016；5 青海大学，西宁 810016)

青海省柴达木盆地是中国枸杞的原生地之一。盆地独特的自然环境和高原气候孕育出珍稀的植物资源——黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)。它是茄科枸杞属多年生灌木，生长在严重盐渍化的荒漠地区，是特有且稀有的缓解土壤盐碱度和防止土壤荒漠化的多棘刺灌木，对青海偏远地区的生态系统稳定意义重大[1-2]。同时，其黑色浆果在中国和其他亚洲国家已被多年用作传统中药材，能提高视力、抗突变、预防心血管疾病[1,3]等，其营养和药理价值的发挥，主要依靠黑果内丰富的花青素，其次为维生素、微量元素、多糖和油类物质[1-5]等化合物的活性。

但是，在2013～2015年对青海全省黑果枸杞野生资源进行清查时，发现了整株都是白色浆果的植株。白色果实在颜色表型消失的基础上，其他使黑果枸杞果实具有营养和药理价值的活性化合物的含量是否也发生了变化？因此，本研究以成熟后期3个时期的黒果枸杞白色和黑色浆果为材料，对其表型、花青素、多糖、多酚、矿质元素以及维生素E的含量进行了测定和对比分析，为黑果枸杞品种选育、白果的营养价值评判及其适应性研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

黑果枸杞果实成熟后期的3个发育期是果实迅速膨大、花青素等内含物大量累积的时期。其中，时期Ⅰ：果实完全着紫色，开始膨大，硬度变小；时期Ⅱ：果实紫黑色，迅速膨大；时期Ⅲ：果实黑色，完全膨大(图 1)。本研究中，于2016年8月在青海省柴达木盆地格尔木市(36°42′N、95°29′E)500 m2人工黑果枸杞种植地中随机选取黑果和白果健康植株各20株，一次性取3个不同时期的浆果样品。每个发育期用剪刀随机采集15包样品，每包大约20～50颗果实，进行后期5个生理指标的检测，每个指标重复3次。样品采集后迅速用锡箔纸包好液氮速冻，储藏于-80 ℃冰柜备用。

1.2 测定指标及方法

1.2.1花青素含量花青素的测定采用Zeng 等[3]的方法。取约2 g左右的新鲜果实在液氮中充分研磨。取其中500 mg加入5 mL 1%HCl/CH3OH(v/v)。4 ℃黑暗浸提24 h。将混合液在4 ℃、10 000 r/min离心30 min，将上清液转移一个新的10 mL离心管中。向剩余沉淀中加入2 mL 1%HCl/CH3OH(v/v)。重悬后4 ℃黑暗浸提24 h并离心。合并上清液，定容至10 mL。利用0.22 μm微孔过滤膜过滤上清液。用紫外可见光光度计在530 nm处测定。试验重复3次。

A、B. 黑果枸杞白色浆果的3个发育时期(正面和立面)；C、D.黑果枸杞黑色浆果的3个发育时期(正面和立面)图1 不同发育时期(Ⅰ～Ⅲ)的黑果枸杞白色及黑色浆果A, B. The coloration phenotype of white fruit plan and elevation views at different development stages; C, D. The coloration phenotype of black fruit plan and elevation views at different development stagesFig.1 Berries of L. ruthenicum Murr. at different developmental stages(Ⅰ-Ⅲ)

1.2.2多酚含量采用 Folin-Ciocalteau法进行多酚含量的测定。取约2 g左右的鲜果，在电热鼓风干燥箱中65 ℃干燥48 h。将烘干的果实充分研磨至粉末状。取其中500 mg左右的粉末于50 mL离心管中。加入25 mL 50%CH3OH溶液，震荡提取30 min。用超声波提取40 min，4 ℃、9 000 r/min离心15 min。滤渣用相同提取工艺提取至滤液无表色。合并滤液定容至50 mL容量瓶中，经0.22 μm微孔过滤膜过滤。取1 mL过滤提取液定容至10 mL。取1 mL稀释样品置于25 mL试管中。依次加入5.0 mL蒸馏水、2.5 mL 10% FC试剂。充分震荡后静置3 min后，加入4.0 mL 12% Na2CO3溶液摇匀。35 ℃下恒温水浴1.5 h。显色后利用紫外可见光光度计在620 nm处测定并计算。试验重复3次。

1.2.3多糖含量采用蒽酮-硫酸法进行多糖含量的测定。取约2 g左右的黑果枸杞鲜果，在电热鼓风干燥箱中65 ℃干燥48 h。将烘干的果实充分研磨至粉末状，取500 mg粉末于10 mL离心管中。加入5～6 mL 80%乙醇溶液，80 ℃下水浴30 min，期间对其进行震荡，混合液冷却后在4 ℃、3 500 r/min离心10 min。将上清液转移到25 mL离心管中，滤渣用相同提取工艺提取至滤液无表色，重复浸提2次。合并滤液用80%乙醇溶液定容至25 mL离心管中。吸取2 mL置于10 mL离心管在沸水浴中蒸干，准确加入10 mL蒸馏水，充分搅拌使糖溶解。4 ℃、3 500 r/min离心5 min，取1 mL上清液稀释30倍。取2 mL稀释液置于10 mL试管中，将已加入稀释液的试管放入冰水浴中。将5 mL蒽酮-H2SO4试剂沿试管管壁缓慢加入，待全部加完后混匀冷却。混合液试管放入100 ℃水浴锅中准确加热10 min。取出后用自来水冷却至室温。紫外可见光光度计在620 nm处测定并计算。试验重复3次。

1.2.4矿质元素含量采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行元素含量的测定。将干燥处理的黑果枸杞研磨成细粉末。称取0.2 g干燥样品置于聚四氟乙烯消解罐。加10 mL浓HNO3进行消化。在将聚四氟乙烯消解罐密封前静置约2 h。在微波消解系统中进行样品的溶解。待样品完全溶解后进行脱酸并用双蒸馏水进行稀释后用于测量。样品溶液通过7500ce电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)系统进行分析。试验重复3次。

1.2.5维生素E含量采用高效液相色谱法进行维生素E(VE)活性成分的测定，并以国标GB/T 5009.82-2003)为参照。试验重复3次。

1.3 数据处理

利用SPSS18.0对黑果枸杞主要活性成分实验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 2种黑果枸杞果实表型比较

通过对白、黑果成熟后期的果实纵径、横径以及质量的测定发现，枸杞白果、黑果果实纵径随着发育进程而缓慢增加，而果实横径在Ⅰ、Ⅱ时期缓慢增加，到第Ⅲ时期急剧增加，导致这一时期的果型指数相较于前两个时期的变化不明显到急剧下降，果型呈现明显“蟠桃型”，但白果、黑果各发育时期内两两比较变化不明显；白果、黑果的单果重随着发育进程不断增加，而同期内两两比较差异不大(表1)。以上结果说明，白果和黑果枸杞果实的发育进程相近，果型一致，体积、质量差异不大，而且果实体积的膨大主要发生在第Ⅲ时期。

表1 不同发育时期黑果枸杞浆果的表型性状

注：表中数值为3个重复的平均值，表示为平均值 ± 标准差；相同时期内**和*分别代表2种果实间在0.01和0.05水平存在显著性差异；下同

Note: The figures in table are means of three replicates, and indicated as mean±SD; ** and * within same stage indicated significant differences between white fruit and black fruit as calculated by Duncan statistical analysis at 0.01 and 0.05 level, respectively；The same as below

2.2 2种黑果枸杞果实花青素、多酚和多糖含量的比较

成熟的黑果枸杞黑色浆果中含有丰富的乙酰化的花青素[1,6]。通过对色素大量累积时期的白果和黑果中花青素测定发现，二者花青素含量在3个时期均存在极显著性差异(P<0.01)。同时，黑果中的花青素含量随着果实膨大，从5.50 mg/g迅速增加至17 mg/g，然后有所下降；白果中花青素含量在3个时期均处于很低水平，且基本保持平稳(表 2)，花青素的大量消失是其果实颜色呈现白色的原因。

同时，酚类化合物是广泛存在于高等植物中的活性化合物[7]。作为一类重要的次生代谢物，多酚因为可以保护人体免受氧化危害，比如癌症、心血管问题、衰老[7-8]等而受到了高度关注。表2显示，黑果枸杞黑果和白果中的多酚含量随果实发育的变化趋势相似，都明显呈现先增加然后有所回落；整体上，白果中也具有可观的多酚含量，但是黑果中各个时期的多酚含量均明显高于白果，且在第Ⅰ、Ⅲ时期均存在显著性差异。

另外，多糖是细胞的4个基本组成部分之一[9]，它被认为是一种主要的抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫调节、降血糖、抗肿瘤的活性物质。从表2可知，黑果枸杞白果中虽有多糖的存在，但是其含量在3个时期均显著低于黑果；白果和黑果中的多糖含量都随发育进程而增加，都在第Ⅲ时期达到最大，不同于花青素和多酚含量的表现。

2.3 2种黑果枸杞果实中矿质元素含量的比较

矿质元素对于人体的发育必不可少[10]。利用 ICP-MS 测定了2种黑果枸杞果实中17种矿质元素

(B, Ca, Co, Cr, Cu, Fe, K, Li, Mg, Mn, Na, P, Si, Ti, V, Zn, Al)的含量。表3结果显示，K、 Na、P、Ca、Mg 是2种黑果枸杞浆果中含量最高的5种元素，尤其是K的含量非常高，是Na含量的5倍之多，其属于高钾低钠的植物。2种浆果间比较，白果中的B、Ca、Li、Mg、Mn、Na、Si含量在3个时期均显著高于同期的黑果，而其Cu、Fe、Ti的含量在3个时期均低于黑果，且其间Cu、Fe含量存在显著性差异；浆果中的Co、Cr、P、V 4种元素的含量在黑果和白果中不存在显著性差异；浆果中的K、Zn和Al含量在黑、白果的发育过程中一直在波动变化，但是它们在第Ⅲ时期表现为白果含量高于黑果，且两者间的K含量存在显著性差异，Zn和Al含量存在极显著性差异(表3)。

2.4 2种黑果枸杞果实中维生素E含量的比较

维生素E(VE)作为一类人体不能合成、需从外界摄入补充的微量营养元素，在增强人体免疫系统功能方面起着重要作用[11]。维生素E由一组复合物组成，包括α-(α-Toc)、β-(β-Toc)、γ(γ-Toc)和δ-(δ-Toc) 生育酚和4个相应的不饱和衍生物[12]。其中的α-Toc的生理活性最强，是人体最易吸收的生育酚，而γ-Toc的抗氧化能力最强[13]，所以，本研究对黑果枸杞黑、白2种浆果VE中的这2类进行了含量的测定。结果(表4)表明，黑果枸杞黑、白2种浆果中都有α-Toc、γ-Toc这2类物质存在，且α-Toc的含量明显较于γ-Toc含量丰富。α-Toc的含量在黑、白果中都于第Ⅱ时期比较高，后随着浆果发育反而有所下降；黑果中的α-Toc含量在第Ⅱ、Ⅲ时期均显著高于白果，而在第Ⅰ时期显著低于白果。γ-Toc的含量整体上处在较低水平，在黑、白果的各发育时期虽有差异，但差异仅在第Ⅲ时期达到显著水平，并表现为白果高于黑果。

表2 不同发育时期2种黑果枸杞浆果中的花青素、多酚、多糖含量

表4 不同发育时期2种黑果枸杞浆果中的维生素E含量

3 讨 论

黑果枸杞广泛地分布于青藏高原的盐化荒漠，它特殊的抗旱、抗盐生理特性对于青海地区柴达木盆地生态系统的稳定非常重要。强烈紫外线和恶劣土壤环境诱导黑果枸杞的浆果内特异性地积累了大量花青素[4,14]，这种类黄酮物质不仅能增强植株自身抗逆性，使其在逆境中正常生长发育而得以在青海存活[15-19]，还对人体有重要的医疗保健作用。因此，黑果枸杞是柴达木盆地重要的生态、经济型树种，但到目前为止，依旧以野生种为主，优良品种缺乏。在品种选育、资源清查过程中，我们发现了浆果全是白色的黑果枸杞植株。对两种颜色果实表型的对比分析发现，二者除了果色不同外，没有差异。

果色是果实品质的重要指标，花青素是决定果色的主要色素，也是果实成熟的主要标志。对于水果、蔬菜和粮食作物来说，传统品种多为淡色。花青素虽然因其抗氧化性对人类具有保健功能，但它们会使口感偏涩[20-21]。近年来，随着人类心血管疾病、糖尿病、肥胖和癌症的频发，花青素的保健功能已经引起了人们的重视。这种类黄酮物质，对于植株本身而言，能增强自身抗逆性，能使其在逆境中正常生长发育[17-19]。因此，花青素是黑果枸杞浆果内最重要和最具有生态价值和经济价值的内含物[1]。本研究中黑色鲜浆果内花青素的含量在发育第Ⅱ时期高达17.18 mg/g，远高于已报道的其他深色果实，其花青素含量是越桔属(Vaccinium) 30 个基因型的1.8～27.6倍，是悬钩子属(Rubus) 37 种和栽培种的1.5～18倍，是虎耳草科(Ribes) 40个基因型的2.3～66.9倍[22]。这在可食用浆果中非常罕见[23]。但是，黑果枸杞白色果实中花青素含量在3个时期均极低，且趋于平稳，说明花青素的大量消失是果实颜色呈现白色的根本原因。花青素积累的完全阻断很可能会降低植株抗逆性，使其适应柴达木盆地恶劣环境的能力受限，对浆果品质的影响也是致命的。众多研究已表明，从无色向红紫色品种转变常由花青素调控因子MYB或b HLH的表达上调引起，而红紫色向淡色转变可由多种机制引起，如任意一个花青素合成途径结构基因或相关调控因子的突变。自然界相同环境条件下形成的淡色突变品种中，调控基因MYB和结构基因F3′H与F3′5′H的突变出现频率较高[21]。下一步我们将会利用转录组深度测序对黑果枸杞颜色代谢机理进行系统研究，结合适应性的长期监测，以期从分子水平揭开黒果枸杞黑色浆果花青素累积与白色浆果颜色缺失的机理，并阐明花青素的多寡对其适应性的影响。同时，多酚、多糖、元素和维生素E也是黑果枸杞浆果发挥保健功能的重要内含物[1-2]。通过对比发现这些活性物质在黑、白果中都存在、都有各自的优势值，且都在果实发育的第Ⅱ、Ⅲ时期中含量达到最高，而多酚、多糖和VE的含量在白果中虽然也很可观，但在各个时期均显著低于黑色果实；但值得关注的是，多种矿质元素含量则在白果中表现比较佳。

在今天，消费者追求多功能食物和果实品质。黑果枸杞白色果实相较于黑色果实，逊色于健康促进(花青素、多糖、多酚)和营养价值(维生素E)，但是天然存在的白色形式具有极高的科研价值，它为深刻理解苛刻的高原环境下复杂的代谢网络和特定的生化特性，尤其为花青素高效累积下的深色颜色的形成以及花青素与适应性之间的关系提供了珍贵材料。