郭远薇 胡政 罗伟濠 贺荣章 李佳 段丽丽 刘小军 罗迪贤

乳腺癌是来源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，也是我国女性发病率最高的恶性肿瘤。近年来随着乳腺癌诊疗手段的改进，其5年生存率明显升高［1]。上海市乳腺癌临床医学中心的数据显示，乳腺癌患者术后5年生存率从10年前的79.8%提高到89.9%，提高了10.1%。与同一时期国际权威机构报道数据比较，美国乳腺癌患者5年生存率从2000年的84.0%提高到2010年的89.0%，上升了5.0%［2-4]，可见带病生存的晚期乳腺癌患者占比越来越高。乳腺癌广泛侵袭和转移后未获得及时有效的诊治成为患者死亡的主要原因，因此通过多手段监测，及时、有效地发现肿瘤复发以及准确评估疾病进展，有助于进一步延长患者的生存期。

目前诸多的癌症相关肿瘤标志物研究更着重于癌症早筛早诊，以使患者能在发病早期通过肿瘤扩大根治手术进行R0切除，从根本上改善患者的预后。然而目前针对乳腺癌早诊早筛的大部分研究均未取得实质性进展。乳腺癌所有的早期筛查手段虽然可以在一定程度上降低其死亡率，但同时也有一定局限性［4-5]。因此，对于生存率不断改善的乳腺癌血液循环标本是诸多人体标本中少数既满足微创，又携带丰富病情信息的活体标本，是监测乳腺癌复发和病情评估更便捷、高效，且易获取得的微创手段。循环肿瘤标志物目前已经被广泛应用于多种恶性肿瘤患者的筛查、诊断、复查、治疗效果评估等，本文就循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（ciculating tumor，ctDNA）和外泌体等循环肿瘤标志物的生物学特性及其在乳腺癌诊疗中的应用展开综述。

1 循环肿瘤细胞在乳腺癌复发和预后评估中的应用

近年来研究最多的循环肿瘤标志物主要有CTCs和ctDNA。CTCs是指实体肿瘤原发病灶或者转移病灶中脱落的进入血液循环系统的恶性肿瘤细胞［5]。CTCs在血循环中数量较少，但可发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），这使CTCs具有更强的变形和趋化能力，亦加速了肿瘤细胞播散转移的速度［6]。CTCs还具有很强的细胞成团能力，极易发展成循环肿瘤微栓（circulating tumor micro-plug，CTM），而 CTM 被认为比 CTCs具有更高的转移潜能力。CTCs还具有一定的自我种植能力，可在肿瘤细胞衍化生成的炎性因子（IL-6、IL-8）的趋化诱导作用下，依靠基质金属蛋白酶1（MMP1）和肌成束蛋白酶（FSCN1）渗透组织基底层再次回到肿瘤原发灶，进行克隆性增殖。这一现象解释了乳腺癌肿块在完整切除后仍会复发的原因，可见CTCs是研究乳腺癌复发和转移的关键环节［7-9]。有研究发现肿瘤干细胞标志物（EMT标志物，如Twist1、Akt2、PI3Kα等）在乳腺癌转移患者中高表达，证明CTCs中存在携带肿瘤干细胞特性的亚群，并参与EMT过程［10-11]。此外，该研究还证实CTCs在转换生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路和叉头框 C1（forkhead box C1，FOXC1）转录因子信号通路的调控下参与动态EMT过程。还有研究报道转移性乳腺癌CTCs携带程序性死亡配体-1（programmed cell death-ligand1 PD-L1），是抗 PD-L1 治疗的重要靶点［5，12]。2018年全球启用的AJCC第八版癌症分期系统，首次将乳腺癌外周血中的CTCs列为预后提示因子，并认为EMT参与了癌症的转移过程［4]。此外，有研究证实，结合CTC总数和间质型CTC比例的标准，可用于转移性乳腺癌患者治疗耐药性和预后监测，同时明确了无进展生存期（PFS）预测联合标准：CTC总数≥10/5 mL、间质型CTC比例＞10.7%，符合联合标准的患者中位PFS明显较不符合标准的患者短（6.2个月 vs9.9个月，P=0.010）［13]。以上研究表明CTCs是与乳腺癌复发和转移密切相关的外周血循环肿瘤标志物，有望为乳腺癌精准诊疗提供依据。

2 ctDNA及其甲基化在乳腺癌复发与预后评估的应用

ctDNA是指肿瘤患者血液来源的肿瘤细胞坏死、凋亡或者分泌的DNA小片段，长度一般不超过160～180 bp，明显短于正常细胞内的DNA，因此又称为外周游离血DNA（cfDNA）。肿瘤患者血液中ctDNA含量远高于健康人，与肿瘤的发生发展关系密切［14]。有研究报道ctDNA的肿瘤特性如ctDNA最常见的点突变，使其有利于乳腺癌患者早期预测肿瘤复发和转移，且发现p53、PIK3CA、ESR1等乳腺癌相关突变点，但因癌细胞的异质性，随着病情进展突变点也会发生新的改变［15-16]，由此认为ctDNA与乳腺癌复发和病情进展有关，且发生于ctDNA突变可为后续治疗提供新的靶点。因此，ctDNA不仅有利于乳腺癌的病情监测，亦可为后续治疗提供决策依据。

为了验证ctDNA能否用于监测乳腺癌中的微小残留病灶（minmal residnal disease，MRD），有研究者选取55例接受新辅助化疗（new adjuvant chemotherapy，NCT）乳腺癌患者，完成明显治愈性治疗后在单个术后时间点或连续随访样本中检测ctDNA，发现可提高预测其转移复发的准确性，其中连续随访样本中的ctDNA检测提高了复发预测的灵敏度，中位复发时间为7.9个月，进一步证明了ctDNA的靶向捕获测序分析可用于MRD检测，且MRD测序较原发癌的测序可更准确地预测后续转移复发的发生发展，认为ctDNA检测可以识别具有高复发风险的乳腺癌患者［15-17]。有研究发现在NCT期间，ctDNA水平迅速下降且在手术后未检测到最小的残留病灶，而NCT期间ctDNA水平的缓慢下降与较短的存活率密切相关［18]。总之，目前研究认为无创突变追踪外周血中ctDNA可以检测标准治疗后的残留MRD。

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（Dnmt）作用下将甲基选择性添加到胞嘧啶上形成5-胞嘧啶的过程，可调控基因表达是DNA重要的修饰途径［19-20]。DNA甲基化是肿瘤发生过程中较早可观察到的分子之一，常导致相对应的抑癌基因失去活性，致使肿瘤发生发展［21]。血液中ctDNA的含量极少，在微量的ctDNA中检测单个甲基化难度大，但已有学者将这项技术应用于肝癌检测［22]。目前关于ctDNA甲基化与乳腺癌的研究相对较少，有研究者在乳腺癌细胞中发现分析DNA甲基化可以区分上皮和间充质表型，了解DNA甲基化如何在上皮和间充质表型之间变化，有助于更合理地选择基于甲基化的生物标志物用于循环肿瘤DNA分析［23]。目前ctDNA越来越多地用于监测癌症治疗期间的微小残留病灶，但ctDNA的检测依赖于特异性标志物。研究发现用于评估微小残留病灶的一些标志物如AKR1B1和APC甲基化对上皮乳腺细胞系具有特异性，而在上皮细胞和间充质细胞系中亦均观察到RASSF1A、RARβ、TWIST1和SFRP2甲基化，这支持了它们对多标记组的适应性［24]，因此开发类似的方法评估其他标志物监测DNA甲基化，可进一步用于乳腺癌的ctDNA检测。目前乳腺癌ctDNA甲基化研究仍处于早期阶段，但早期乳腺癌细胞DNA甲基化以及ctDNA的研究使ctDNA甲基化具备良好的前期基础，有望在不久的将来用于乳腺癌复发和晚期病情评估，为乳腺癌晚期患者提供新的治疗靶点。

3 外泌体在乳腺癌复发与预后评估的应用

外泌体（Exosome）是指经由细胞内的囊泡运输，从多泡体（multivesicularbody，MVB）排出到细胞外的直径为30～100 nm的细胞外囊泡，在人体中可分布于血液、体液、唾液、乳汁、脑脊液等［25]。外泌体包含了miRNA、lnRNA、cirRNA、DNA以及蛋白质等分子，且与细胞的功能状态关系密切。此外，外泌体在生物学过程、疾病治疗和诊断中扮演着重要角色，在癌症的发生、发展中亦起着重要作用，近几年外泌体被证实参与调控细胞表面蛋白以及多条细胞通路，调节肿瘤微环境的传导。而对于非哺乳期的乳腺癌患者而言，血清外泌体最易于获取且其外泌体内含物与患者病情密切相关。有研究表明，乳腺癌细胞外泌体囊泡内的蛋白质（CD39、CD73及TGF-β）和 miRNA（miR-122、miR-10b、miR-222及 miR-105）参与了乳腺癌复发、转移等过程［26]。RICHES 等［27]研究发现正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞外泌体的分泌是互为作用的反馈调节，即正常乳腺上皮细胞分泌的外泌体会抑制乳腺癌细胞分泌，反之亦然，提示密切检测乳腺癌外泌体的变化可以有效及时地观察乳腺癌治疗疗效以及评估复发风险。近年来非编码RNA（miRNA、lnRNA、cirRNA）为恶性肿瘤研究的热点领域，已有研究明确了非编码RNA与肿瘤细胞分型、分化程度和预后的关系［25]。而绝大多数与肿瘤相关的非编码RNA研究均需要取得新鲜的肿瘤标本，血清外泌体则为非编码RNA的研究提供了更便捷的方法。事实上随着恶性肿瘤的发生和进展，血清外泌体中的非编码RNA、DNA和蛋白质含量和种类均会发生相应变化。因此，血清外泌体也是乳腺癌复发监测和晚期病情评估的有效途径，但仍需进一步研究筛选灵敏度和特异度更高的标志物，以获得更为精准的评估参数。

4 肿瘤血小板在乳腺癌复发与预后评估中的应用

肿瘤血小板（tumor-educated platelets，TEPs）是一类含有与正常血小板不同RNA特殊血小板，可与肿瘤细胞发生相互作用［28]。TEPs是最近新发现的可作为肿瘤RNA的生物标志物，被认为参与肿瘤生长的全身和局部反应。TEPs参与多种实体瘤的进展和扩散，且TEPs RNA的剪接突变提示肿瘤的发生、发生部位和分子特征的特定信息［29-30]。目前，已有学者对来自不同肿瘤类型（包括肺癌、脑癌和乳腺癌）患者的TEPs样本进行测试，结果显示肿瘤患者的TEPs与良性病变和其他非癌性疾病患者的TEPs不同［31-32]。但尚未清楚血小板如何“肿瘤化”，仍需进一步探索导致血小板内部RNA剪接的机制，以及特定血小板亚群之间相互变化与癌症病情的相关性。有研究者通过283个血小板样品的mRNA测序确定了TEPs与肿瘤的相关性，该研究对比了55名健康对照和228例有局部复发和远处转移肿瘤患者的TEPs，肿瘤复发预测准确率达96%，且发现在6种不同肿瘤类型中，原发肿瘤位置被正确识别，准确率为71%［27，29]。该研究结果表明，肿瘤血小板与肿瘤复发、转移、多发原位癌发生发展均有关，可能成为“液体活检”的一部分，而用于乳腺癌的复发和晚期病情评价。

5 小结

乳腺癌的传统预后和复发预测指标包括雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和原癌基因人类表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等，基于此及乳腺癌分子分型，可帮助患者选择内分泌治疗和靶向HER2治疗。但是以上方法存在取材次数，检测方法以及诊断主观性强等缺点。乳腺癌病情进展往往从微转移开始，检测乳腺癌患者微转移状态有助于早期定位复发及转移的高危人群，对加强患者随访、采取相应治疗措施、减少肿瘤复发转移及提高患者生存率具有重大意义［33]。骨髓中微转移细胞即弥散肿瘤细胞虽然对乳腺癌患者具有独立的预后预测价值，但需要进行侵入性较大的骨髓穿刺。而循环肿瘤标志物（包括CTCs、ctDNA、ctDNA甲基化、外泌体以及TEP）检测取材创伤小，且可同时检测的标志物种类较多，提供的病情信息更全面。长久以来，TNM分期是乳腺癌病情评估和预后判断的依据，也是患者手术指征的主要判断标准。近年来随着乳腺癌患者5年生存率不断提高，TNM分期中晚期带瘤生存的患者越来越多，而这些患者中部分患者的预后与TNM分期出入较大，因此有必要进一步引入分子生物学分期。未来应对循环肿瘤标志物深入研究，将每一个循环肿瘤标志物与乳腺癌患者的生存期和预后的关系进行大样本调查，以获取更丰富的数据，从而制定更精准的分期标准。而精确的分子生物学分期标准结合经典的TNM分期，有望为乳腺癌患者制定更符合其病情的诊断和分期标准，从而更精确评估患者复发和晚期病情制定个体化治疗方案。

综上所述，循环肿瘤标志物在乳腺癌复发监测和晚期病情评估中有着良好的应用前景，同时一些循环肿瘤标志物的突变位点变化有望为乳腺癌的治疗提供新的靶点，以及为乳腺癌患者个体化治疗提供更多循证依据。但是目前外周血肿瘤循环标志物高昂的检测费用，很大程度上限制了它在临床的应用，循环肿瘤标志物与乳腺癌病情的关系，以及操作更简便、成本更低廉的检测方法仍需进一步研究，以改善晚期带瘤生存患者的生存质量。