尚潇潇，朱 琳，罗孝菁，饶 毅，唐 祥，张程瑞，蒲 祥

四川农业大学理学院，雅安 625014

喜树(Camptothecaacuminata)，为我国特有二级野生保护植物，主要分布于中国长江流域及西南各省[1]。1966年由Wall等首次从树皮中分离获得喜树碱(Camptothecin)[2]，其衍生物伊立替康、拓扑替康相继被开发用于多种实体瘤如结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、恶性淋巴瘤等的临床治疗[3]，已成为抗肿瘤药物市场上的主要品种之一，具有较大市场销售额。喜树因全株含有喜树碱及喜树碱类似物而受到持续关注，现已成为市场上喜树碱及其衍生物产品获取的主要植物资源之一[3]。此外，喜树富含多种代谢产物，研究人员先后从喜树的叶、果实、根、树皮中发现了一百余种化合物，其中包括喜树碱在内的喹啉类生物碱以及吲哚类生物碱四十余种[4-7]，然而与日俱增的市场需求导致喜树资源遭到破坏。

要实现喜树资源的充分利用和探明代谢产物随时间的变化规律，均需要对喜树进行代谢产物轮廓分析。以甲基橙为显色剂，杨磊等[8]构建了喜树中总生物碱的萃取光度法。余响华等[9]应用乙醇浸提法优化喜树果中生物碱提取工艺。Montoro 等[10]以70%乙醇作溶剂对温室培养喜树叶进行代谢指纹分析，并从中鉴别了24种成分。在代谢组学分析中，提取溶剂和提取方法的选择尤为重要。喜树叶中代谢产物丰富，目前未见叶中总生物碱提取工艺优化及抗菌抗氧化活性报道。由此我们以叶为研究对象，采用超声冷提技术与响应面分析法结合[11]，对喜树叶中的总生物碱成分进行提取工艺优化及抗菌、抗氧化活性测试，为进一步从喜树叶中发掘活性生物碱奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

喜树叶(树体外围新梢，枝顶端1～6位叶)取自四川农业大学雅安校区，树龄：大于十年，采集时间：2017年4月，经四川农业大学杨瑞武教授鉴定为喜树鲜叶(Camptothecaacuminataleaf)。喜树碱对照品(上海阿拉丁试剂有限公司，中国)、2，2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS，C18H24N6O6S4)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，C18H12N5O6)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ，C18H12N6)、丁基羟基茴香醚(BHA，C11H16O2)、抗坏血酸(Vc，C6H5O6)均购自上海阿拉丁试剂有限公司；色谱纯甲醇和乙腈(TEDIA，美国)；无水乙醇、甲醇、甲酸、三氯甲烷、甲基橙、石油醚、二甲亚砜均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂； 0.22 μm和 0.45 μm针头式过滤器(天津津腾实验设备有限公司，中国)；无菌注射器(上海聚民生物科技有限公司，中国)；硫酸卡那霉素(生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)； 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌由四川农业大学生命科学学院提供。

1.2 仪器与设备

HPLC(Agilent，美国)；Specord200Plus紫外可见分光光度计(Analytik Jena，德国)；BT124S电子天平(Sartorius，德国)；SB-5200 DTD 台式超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂，中国)；DHG-9101 型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司，中国)；PHS-3C 型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司，中国)；IMS-50 型制冰机(常熟市雪科电器有限公司，中国)；高压蒸汽灭菌锅(上海华线医用核子仪器有限公司，中国)；SW-CJ-2FD超净工作台(上海博讯医疗设备，中国)；ZWY-240恒温培养振荡器(上海智城，中国)；移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司，中国)。

2 实验方法

2.1 样品的前处理与提取

将新采集的喜树叶鲜样置于恒温干燥箱25 ℃烘至恒重，粉碎过筛，即为喜树叶干样。干样用石油醚浸泡脱色，烘干后样品袋封装-20 ℃保存备用。喜树叶样品粉末0.50 g，加入适量提取溶剂后，超声冷提(0 ℃)，提取液4 000 rpm离心10 min，上清液转入样品瓶，并用提取溶剂定容至5 mL备用，得样品液。

2.2 溶液配置

对照品溶液I：称取喜树碱对照品3.0 mg 于5 mL 容量瓶中，用适量DMSO溶解后乙醇定容，摇匀，配成0.6 mg/mL母液备用。柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液(pH 5)与1.5 mM甲基橙缓冲混合溶液的配置参照杨磊等[8]。

2.3 喜树叶中总生物碱含量测定

总生物碱含量测定采用甲基橙显色法[8]，以对照品浓度X为横坐标、吸光度Y为纵坐标线性拟合，得回归方程Y= 3.711 9X+0.036 1(R2= 0.992 5)。总生物碱含量(mg/g)=样品液中总生物碱浓度(mg/mL)×样品液体积/喜树叶干样质量(g)。

2.4 喜树碱含量测定

对照品溶液II：将喜树碱对照品母液I稀释十倍，即得浓度为60 μg/mL喜树碱对照品溶液II。喜树碱含量测定使用Agilent 1260 Infinity高效液相色谱，色谱条件：色谱柱(InertSustain C18，4.6×250 mm，5 μm分离，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min，G7129A自动进样器进样。流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：甲醇；梯度洗脱程序：0～12 min，5%～50%(B)，12～30 min，50%～80%(B)，30～39 min，80%～98%(B)，39～45 min，98%～98%(B)；检测波长：254 nm，373 nm。自动进样器进样，喜树碱进样量分别为60、300、600、3 000、6 000 ng，以喜树碱进样量X为横坐标，色谱峰积分面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y= 3.73 861X+70.080 71 (R2=0.999 7)。

2.5 单因素实验

以喜树叶生物碱含量为指标，考察提取溶剂(甲醇：甲酸：水(甲醇比例)=12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1；甲醇：氯仿=4∶1、2∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4；乙腈：水=1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，固定料液比1∶10，提取时间30 min，超声功率255 W)、提取时间(10、20、30、40、50 min，固定料液比1∶10，提取溶剂甲醇：甲酸：水=15∶1∶4，超声功率255 W)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定提取时间30 min，超声功率255 W，提取溶剂甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)、超声功率(120、165、210、255、297 W，固定提取时间30 min，料液比1∶10，提取溶剂甲醇：甲酸：水=15∶1∶4)以及甲醇比例(6∶1∶13、9∶1∶10、12∶1∶7、15∶1∶4、18∶1∶1，固定提取时间30 min，超声功率255 W，料液比1∶10)5个因素对总生物碱含量的影响。

2.6 响应面优化实验

根据单因素实验结果，选取料液比、超声功率、甲醇比例为自变量，以总生物碱提取率为响应值，利用Box-Benhnken中心组合设计3因素3水平试验(见表1)。用Design Expert 8.0进行数据分析，最后通过模型验证得出总生物碱超声冷提最优条件。

表1 响应面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

2.7 抑菌活性测试

参照药品微生物测试方法[12]，用二倍稀释法将样品配制成一定浓度梯度1.0 mL样品，选取硫酸卡那霉素作为阳性对照，M17.5F1W1.5溶液为阴性对照，每组平行测定3次。

2.8 抗氧化活性测定

2.8.1 总抗氧化能力的测定(FRAP法)

参照Benzie建立的方法，并稍作修改[13]。以M17.5F1W1.5溶液为空白对照，以BHA和Vc作为阳性对照，每组平行测定3次。以0.2～1.6 mmol/L的FeSO4的标准溶液测试并绘制标准曲线。样品的总抗氧化能力以达到同样吸光度所需的FeSO4的量表示[14]。

2.8.2 DPPH自由基清除活性

参照Brand-Williams建立的方法，并稍作修改[14]。以M17.5F1W1.5溶液为空白对照，BHA和Vc作为阳性对照，每组平行测定3次。清除率(RSA)计算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替样品测得的吸光度；A1—样品、BHA或Vc的吸光度

2.8.3 ABTS自由基清除活性

参照Re建立的方法，并稍作修改[15]。以BHA和Vc作为阳性对照，每组平行测定3次。清除率(RSA)计算公式如下：

式中：A0—M17.5F1W1.5溶液代替样品测得的吸光度；A1—样品、BHA或Vc的吸光度

2.9 数据分析

所有试验重复三次，实验数据用SPSS 17.0进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 提取溶剂考察

以甲基橙法评估三种不同溶剂体系提取总生物碱收率，结果如图1，MC体系收率最高，且随溶剂比例变化影响显著，MC比例为1∶1时(v/v)，总生物碱收率最高可达1.84±0.11 mg/g，但存在有色物质干扰；MFW体系收率较为稳定，保持在0.47±0.27 mg/g水平；AW体系溶剂比例显著影响总生物碱收率，AW比例为3∶1(v/v)时收率最高0.50±0.01 mg/g。随后对M1C1、M15F1W4、A3W1三种溶剂提取样品进行HPLC对比分析，373 nm波长检出色谱峰数M15F1W4(30个)>A3W1(25个)>M1C1(17个)，色谱峰强度M15F1W4>A3W1>M1C1，喜树碱提取量M15F1W4>A3W1>M1C1，喜树碱色谱峰面积占比A3W1(9.99%)> M1C1 (8.48%)>M15F1W4(7.28%)。由此可知，M15F1W4体系提取总生物碱种类更为丰富，故后续实验选用MFW作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对总生物碱提取率的影响Fig.1 The yield of total alkaloids extracted with different extraction solvents

3.1.2 料液比考察

实验结果如图2A所示，总生物碱提取率随溶剂用量增加逐渐增大，影响显著，料液比达1∶20时，提取率最高可达0.88±0.03 mg/g，但继续增加至1∶25时，总生物碱提取率略微下降。因此选择1∶15、1∶20、1∶25进行响应面分析。

3.1.3 超声时间考察

如图2B，总生物碱提取率随超声时间增长逐渐升高，10～40 min时，总生物碱提取率由0.43±0.03 mg/g升至0.71±0.02 mg/g，但超声时间至20 min时，仪器开始产热，增长至50 min时，超声产热严重，可能会破坏部分生物碱结构，因此后续试验超声时间设定为40 min，并结合使用冰浴持续控温。

3.1.4 超声功率考察

结果如图2C，超声功率在一定程度影响总生物碱收率，总生物碱收率随超声功率升高而增高，升至255 W后达到最高值0.68±0.02 mg/g，继续增加超声功率，总生物碱收率不再继续增加，可能样品中生物碱已基本溶出，因此选择210、255、297 W进行响应面分析。

3.1.5 甲醇比例考察

结果如图2D，MFW溶剂体系里甲醇比例对总生物碱收率存在影响，甲醇比例由30%升至75%时，生物碱收率逐渐上升，继续升高甲醇比例，生物碱收率略微下降，可能跟叶中生物碱极性有关，甲醇比例为75%(M15F1W4)时，总生物碱收率为0.49±0.03 mg/g，因此，选择甲醇比例为60%(12∶1∶7)，75%(15∶1∶4)，90%(18∶1∶1)进行响应面分析。

图2 料液比(A) 、超声时间(B) 、超声功率(C)、甲醇比例(D)对总生物碱提取收率的影响Fig.2 Effects of solid to liquid ratio(A),ultrasonic time(B),ultrasonic power(C),methanol ratio(D) on the yield of total alkaloids

3.2 响应面优化结果及分析

3.2.1 响应面实验设计及结果

以单因素试验为基础，根据二次回归组合试验设计原理，以喜树总生物碱含量为响应值，设计料液比(A)、超声功率(B)、甲醇比例(C)三个因素进行响应面试验(见表2)，试验结果进行多元线性回归拟合，得到喜树叶总生物碱提取量对料液比(A)、超声功率(B)、甲醇比例(C)的二次多项回归方程：Y=1.62-0.091A+0.020B+0.28C+0.15AB-0.12AC-0.067BC-0.34A2-0.17B2-0.19C2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

3.2.2 回归模型方差分析与显著性检验

回归模型方差分析使用Design-Expert 8.0，以确定三种因素对喜树叶总生物碱提取率的影响程度和检验回归方程有效性(见表3)。一次项A、C，二次项A2、B2、C2，交互项AB、AC、BC对喜树总生物碱提取率的影响显著，各因素与总生物碱提取率呈较明显的二次抛物线关系，表明回归方程拟合性较好，同时表明各交互因素在响应值(总生物碱含量)存在最大值。分析方程方差可知，由总模型P<0.000 1可知本实验所选取的二次多项式模型具有高度的显著性；失拟项为0.050 4>0.05，表明失拟项不显著，相关系数R2=0.989 7，模型拟合度较好，此模型可在一定范围内用于分析和预测超声辅助提取喜树叶中总生物碱的效果。各因素影响大小顺序为：甲醇比例(C)>超声功率(A)>料液比(B)。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

续表3(Continued Tab.3)

方差源Source平方和Sum of squares自由度Df均方和Mean squareF值F valueP值P value显著性SignificanceBC0.01810.0187.040.0328∗A^20.5010.50197.42< 0.0001∗∗B^20.1210.1245.430.0003∗∗C^20.1610.1663.15< 0.0001∗∗残差Residual0.01872.533E-003---失拟项Lack of Fit0.01534.913E-0036.560.0504-纯误差Pure Error2.996E-00347.491E-004---总体Cor Total1.7216----

注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.001)。
Note:*represented significant difference(P<0.05),**represented extremely significant difference(P<0.001).

3.2.3 交互作用分析

图3A-B 显示了超声功率与料液比对喜树中总生物碱提取量的交互作用，等高线呈椭圆形，且交互曲面陡峭，说明交互作用显著，响应值随着超声功率和料液比的改变先上升，后略微下降，存在最大值。图3A-C 显示了甲醇比例与超声功率对喜树中总生物碱提取量的交互作用，等高线呈椭圆形，甲醇比例与超声功率之间的交互作用较为显著。图3B-C 显示了甲醇比例与料液比对喜树中总生物碱提取量的交互作用，等高线椭圆形，故甲醇比例与料液比之间的交互作用较为显著。交互作用分析结果与方差分析结果一致。

图3 各交互作用对总生物碱影响的响应曲面(A-B、A-C、B-C)Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total alkaloids(A-B、A-C、B-C)

3.2.4 验证试验

由Design Expert 8.0软件分析，得出喜树叶中总生物碱提取的理论最优条件为：超声功率为239.25 W，甲醇：甲酸：水为17.64∶1∶1.36，料液比为1∶22.3 g/mL。考虑到可操作性，将试验条件修正为：超声功率240 W，甲醇：甲酸：水为17.5∶1∶1.5，料液比为1∶22 g /mL，所得提取总生物碱的平均含量为1.67±0.08 mg/g(n=5)，与预测值1.75 mg/g 接近，相对误差4.57%，表明优选的工艺条件稳定可行。

3.3 抑菌活性

抑菌活性测试表明，使用最优条件提取制备的喜树叶总生物碱提取物(LAE)对S.aureus、E.coli和P.aeruginosa具有抑菌效果，MIC值分别为4.38、8.75、8.75 μg/mL，对B.subtilis无明显抑制效果，阴性对照MFW溶剂无抑菌活性，阳性对照卡那霉素抑菌活性强，具体结果见表4。

表4 总生物碱提取物对四种菌的最小抑制浓度(MIC),n=3Table 4 MIC of leaf total alkaloid extract(μg/mL),n=3

3.4 抗氧化活性测试

抗氧化活性测试结果见表5。LAE的质量浓度为0.01 mg/mL时，其FRAP值为5.062 ± 0.223 mM，而质量浓度为0.01 mg/mL 的BHA和Vc总抗氧化能力相近，其FRAP值分别为0.16 ± 0.01 mmol·L-1、0.16 ± 0.01 mmol·L-1。LAE、BHA、Vc对DPPH和ABTS自由基清除能力以半抑制浓度IC50表示，BHA与Vc对DPPH和ABTS自由基的清除能力基本相当，而LAE对两种自由基的清除能力比BHA和Vc强。

表5 总生物碱提取物抗氧化活性测试(μg/mL)，n=3Table 5 Antioxidant capability of the LAE(μg/mL),n=3

4 结论

自从喜树中发现喜树碱以来，人们长期致力于从喜树中发掘新的喜树碱类抗肿瘤活性成分，而忽视了对喜树中其它生物碱类成分的开发与利用。本文以喜树叶为对象首次开展超声波冷提总生物碱，通过响应面法优化提取工艺，确定最佳提取工艺为超声功率240 W，甲醇：甲酸：水为17.5∶1∶1.5，料液比1∶22 g /mL，总生物碱的提取率为1.67±0.08 mg/g 。该法简便易行，实用性较高，用途较广。低温提取确保了提取样品中代谢产物结构的完整性，响应面优化确保了提取样品中生物碱类成分的多样性。抗菌测试结果表明LAE具有较好的抑菌活性，对S.aureus、E.coli和P.aeruginosa三种菌株的MIC值分别为4.38、8.75、8.75 μg/mL。同时，LAE呈现优于BHA和Vc的抗氧化活性，其FRAP值为0.16±0.01 mmol·L-1，对 DPPH和ABTS自由基清除半抑制浓度分别为4 μg/mL和3 μg/mL。本研究为喜树叶中总生物碱的进一步开发利用奠定了基础。