■ 李英英 宋铁英 江兴龙 葛均青 陈 曦2，*

（1.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门361021；2.福建省特种水产配合饲料重点实验室，福建福州350300；3.福建省农科院生物技术研究所，福建福州350003）

我国的水产养殖业经过30多年的发展，目前产量已经位居全球首位[1-2]，但随着水产养殖集约化和规模化的发展，水产动物病害频发。嗜水气单胞菌是水产养殖动物暴发性传染病的主要病原菌之一[3]，在生产上有极大的危害性。目前长期大量使用抗生素的防治措施容易使病原菌产生耐药性[4-5]，因此，研究抗生素或化学药物替代品已成为当前研究的热点和难点[6]。

卵黄抗体（IgY）具有类似哺乳动物IgG的免疫活性，并且理化性质稳定[7]，特异性强，不产生耐药性[8]，且对肠道正常的菌群无副作用[9]，近年来，卵黄抗体作为抗生素替代品或饲料添加剂已广泛的运用于畜禽疾病的防治[10-12]。前期研究中，本研究团队已经成功制备了多价嗜水气单胞菌肠外膜蛋白（MOMP）-ISCOMs保护性抗原[13]，并制备了相应的鱼用功能性卵黄粉[14]，本文拟通过对该鱼用功能性卵黄粉所含抗嗜水气单胞菌MOMP卵黄抗体的效价和特异性分析，结合对鳗鲡的免疫攻毒保护和投喂生长性能分析，为该鱼用功能性卵黄粉防控嗜水气单胞菌所引起的疾病提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 鱼用功能性卵黄粉所含卵黄抗体效价及特异性分析

1.1.1 ELISA法检测卵黄抗体免疫效价

以前期研究[15]中所获得的3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水气单胞菌外膜蛋白（MOMP）作为包被物（3株菌MOMP的蛋白比例为1∶1∶1），包被量为10 μg/ml，第1抗体为1∶20开始倍比稀释的卵黄抗体，第2抗体为1∶20 000稀释的HRP酶标记羊抗鸡IgG（Sigma）。OPD显色，终止后读取OD492值，以S/N≥2.1结果为阳性。

1.1.2 卵黄抗体Western blot分析

将上述3株代表菌（ZN1、TPS30和WC）的嗜水气单胞菌外膜蛋白（MOMP）进行SDS-PAGE电泳，半干法转印至NC膜，用5%BSA封闭后依次加入第1抗体和第2抗体进行孵育。其中第1抗体为1∶100稀释的卵黄抗体，第2抗体为1∶20 000稀释的HRP酶标记羊抗鸡IgG（Sigma）。DAB法显色。

1.2 鱼用功能性卵黄粉对鳗鲡的免疫攻毒保护试验

试验鳗鲡购自福建省长乐某鳗鲡场，规格为（80±5）g/尾，18尾随机分为试验组和对照组，每组9尾。鳗鲡在试验室鱼箱中养殖，温度25℃左右，每日换水1/3。对照组投喂鳗鲡饲料，试验组在鳗鲡饲料中添加0.3%鱼用功能性卵黄粉，每天上午和下午各投喂一次，连喂13 d后，2组鳗鲡每只由腹腔注射1×108CFU的ZN1，每天观察1次，连续观察15 d，计算鳗鲡存活率。

1.3 鱼用功能性卵黄粉对鳗鲡的生长性能测定

鱼用功能性卵黄粉对鳗鲡的生长性能的应用分别在福建省长乐市、尤溪县和福清市的3家商品化鳗鲡养殖场进行,统计试验组和对照组鳗鲡总投料量、总增重量，每口池随机抽取适当尾数鳗鲡测定规格，计算尾数和成活率，比较试验组和对照组增重率、饲料转化率和死亡率。

1.3.1 生长性能测定试验1（长乐）

长乐的某鳗鲡养殖场的试验。随机选取30口同等条件池，15口池设为试验组，15口池设为对照组，试验组每池平均14 758尾，每尾平均123.1 g，对照组每池平均11 156尾，每尾平均137.9 g。鱼用功能性卵黄粉按0.3%的量拌料口服，对照组投喂未添加鱼用功能性卵黄粉的同质饲料，养殖周期109 d。

1.3.2 生长性能测定试验2（尤溪）

在尤溪县鳗鲡养殖场，随机选取4口同等条件池，2口池设为试验组，2口池设为对照组。试验组2口池塘分别为21 996尾和21 600尾，均重分别为153.8 g/尾和138.9 g/尾，对照组2口池塘分别为24 528尾和16 720尾，均重分别为142.9 g/尾和131.6 g/尾。按照饲料重量0.3%的比例添加鱼用功能性卵黄粉，混合均匀后投喂。对照组投喂未添加鱼用功能性卵黄粉的同质饲料，养殖周期56 d。

1.3.3 生长性能测定试验3（福清）

在福清市鳗鲡养殖场，随机选取4口同等条件池，2口池设为试验组，2口池设为对照组，养殖品种为日本鳗。试验组2口池塘分别为21 461尾和27 899尾，均重分别为181.2 g/尾和178.6 g/尾，对照组2口池塘分别为18 948尾和26 396尾，均重分别为181.29 g/尾和172.4 g/尾。按照饲料重量0.3%的比例添加鱼用功能性卵黄粉，混合均匀后投喂。对照组投喂未添加鱼用功能性卵黄粉的同质饲料，养殖周期52 d。

2 结果

2.1 鱼用功能性卵黄粉所含卵黄抗体特异性及效价分析

ELISA效价检测显示，鱼用功能性卵黄粉所含MOMP卵黄抗体对嗜水气单胞菌3株代表菌的外膜蛋白（MOMP）抗原的抗体效价均达到1∶10 240（表1）。将鱼用功能性卵黄粉所含MOMP卵黄抗体与嗜水气单胞菌3株代表菌的MOMP进行Western blot染色结果显示，卵黄抗体能与嗜水气单胞菌3株代表菌的MOMP抗原特异结合（图1），说明制备的卵黄抗体具有对嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原的良好特异性。

表1 鱼用功能性卵黄粉对嗜水气单胞菌MOMP抗原的抗体效价

图1 嗜水气单胞菌MOMP卵黄抗体对3种嗜水气单胞菌MOMP的Western-blot结果

2.2 鱼用功能性卵黄粉对鳗鲡的免疫攻毒保护试验（见表2）

表2 鱼用功能性卵黄粉投喂鳗鲡后抵抗嗜水气单胞菌攻击的存活率比较

由表2结果显示，饲喂鱼用功能性卵黄粉13 d后，试验组的鳗鲡攻毒后15 d成活率较对照组提高75.2%（表2），说明鳗鲡饲喂鱼用功能性卵黄粉后对嗜水气单胞菌具有攻毒保护作用。

2.3 鳗鲡饲喂鱼用功能性卵黄粉后生长性能测定

2.3.1 鳗鲡生长性能测定1（长乐）

长乐鳗鲡养殖场的结果显示，添加鱼用功能性卵黄粉的试验组鳗鲡的增重较对照组提高42.9%，饲料转化效率比对照组提高10.7%（图2A），两者死亡率差别均较低，无明显差别（图2B）。

2.3.2 鳗鲡生长性能测定2（尤溪）

在尤溪县鳗鲡养殖场投放按照饲料重量0.3%的比例添加鱼用功能性卵黄粉的饲料的试验结果表明，加功能性卵黄粉前后，试验组平均增重比对照提高了13.6%，平均饲料转化率提高了3.11%（图3A），试验组与对照组的死亡率均较低，差别不显著（图3B）。

图2 长乐某鳗鲡养殖场投喂鱼用功能性卵黄粉生长性能比较

图3 尤溪某鳗鲡养殖场投喂鱼用功能性卵黄粉养殖效果

2.3.3 鳗鲡生长性能测定3（福清）

在福清鳗鲡养殖场，试验组的平均增重及饲料转化率与对照组相比，分别提高了8.88%及2.55%（图4A）。但是加鱼用功能性卵黄粉前后试验组与对照组的死亡率差别明显，试验组较对照组平均死亡率降低了38.8%。

图4 福清某鳗鲡养殖场投喂鱼用功能性卵黄粉养殖效果

3 讨论

卵黄抗体作为饲料添加剂，在水产动物主要应用于鳖和虾类上。李肖梁等[16]使用灭活的嗜水气单胞菌卵黄抗体，添加到中华鳖饲料中发现，卵黄抗体组与对照组在日增重上差异显著。雷勇[17]制备的抗白斑综合征病毒（WSSV）卵黄抗体，能延缓螯虾的死亡时间，使螯虾死亡率从100%降至30%。而抗WSSV卵黄抗体对于提高对虾免疫因子的活性，对于提高抗WSSV感染能力也有一定作用[18]。朱香萍等[19]制备的鳗弧菌卵黄抗体，对虾鳗弧菌感染具有可靠的保护作用。

在本试验中，通过ELISA和Western blot检测，显示制备的鱼用功能性卵黄粉，抗体效价较高，特异性强。在攻毒试验中，经过功能性卵黄粉投喂的鳗鲡攻毒存活率为77.8%，未投喂功能性卵黄粉的鳗鲡攻毒存活率仅44.4%，充分说明该功能性卵黄粉能够增强鳗鲡抵抗嗜水气单胞菌的侵染能力。

生长性能测定结果显示，在鳗鲡饲料中添加0.3%的鱼用功能性卵黄粉后，三组鳗鲡的增重和饲料转化率较对照组均有上升（图2～图4）。其中在增重方面，长乐鳗鲡养殖场的结果最为明显（42.9%），充分表明了鱼用功能性卵黄粉对于鳗鲡生长的促进作用和其应用潜力。增重和饲料转化率均提高的原因，一是鱼用功能性卵黄粉所含的卵黄抗体本身作为优质蛋白源，被鳗鲡吸收后可促进饲料转化率的提高[20]；二是卵黄抗体在肠道中能够阻断嗜水气单胞菌对宿主肠黏膜的黏附作用，中和或抑制毒力因子对宿主细胞的致病作用[21]，从而减少了嗜水气单胞菌等病菌对于其肠道侵扰的几率，提高了肠道对于营养物质的吸收。而在死亡率上，福清鳗鲡养殖场在投喂鱼用卵黄粉前后，试验组和对照组两者间的差别（图4），也充分说明该卵黄粉中的抗体能有效增强鱼体抗嗜水气单胞菌等病菌的能力，从而提高鱼体健康水平和养殖过程中的存活率。

4 结论

通过本文的研究，表明采用0.3%的功能性卵黄粉添加鳗鲡饲料，可有效降低嗜水气单胞菌对于鳗鲡的侵染，降低鳗鲡的死亡率，并能提高生长性能。因此，其可用于嗜水气单胞菌感染引起的鳗鲡疾病的预防和控制。虽然卵黄抗体在产品标准化等方面需要进一步加强[22]，但其作为新型饲料添加剂，将会成为抗生素和化学合成药物的可能替代品，得到更大的研究和开发应用。