谷氨酰胺和精氨酸对乌鳢生长与免疫功能的影响

2019-01-02孔祎頔陈秀梅刘洪健单晓枫陈玉珂王桂芹

饲料工业 2018年16期

■孔祎頔郑伟，2 陈秀梅刘洪健，3 单晓枫陈玉珂王桂芹*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.延边州水产技术推广站，吉林延边133002；3.吉林省水产技术推广站，吉林长春130022）

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是鱼类体内含量最多的必需氨基酸，在代谢过程中至关重要，具有促进鱼类生长发育、提高其抗病能力、改善肠道组成结构及调节免疫功能等作用（王桂芹等，2012）。同时，精氨酸（Arginine，Arg）也作为鱼类体内重要的功能性必需氨基酸，在参与机体蛋白质、一氧化氮、多胺及肌酸的合成，促进动物生长和免疫功能的提高等方面意义深远（王连生等，2017）。Gln受热易分解生成有毒的焦谷氨酸和氨（徐奇友等，2009），但Gln二肽因其稳定性好、水溶性高，已在畜禽生产（姜俊等，2004）和水产养殖（杨奇慧等，2008）等方面有应用。在罗非鱼（Oreochromis mossambicus）（杨奇慧等，2008）、石斑鱼（Epinephelussp）（Lin等，2005）、中华鳖（Trionyxsinensis）（温安祥等，2008）、鲑（Salmoniformes）（陈巨星等，2004）等饲料中添加Gln，可提高生产性能、肠上皮细胞的增殖和分化、免疫功能和抗病和缓解免疫应激的作用。团头鲂（Megalobrama amblycephala）幼鱼适宜生长、氨基酸吸收以及鱼体的免疫力和抗病原菌感染能力强的适宜精氨酸需求量为1.81%～2.35%（廖英杰等，2014）。提高斑点叉尾鮰（Ietaluruspunctatus R）对爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）的抵抗力的适宜精氨酸需求量1.75%～2.45%（Tesser等，2005）、增强吞噬细胞的活性和血液中红细胞的数目（PoMenz等，2014）。关于Ala-Gln和Arg共同添加对乌鳢生长和免疫的影响至今没有相关报道。本试验选取肉质细嫩、口味鲜美、营养丰富、生长快、抗逆性强的名优土著品种乌鳢作为研究对象，探讨在饲料中添加Ala-Gln和Arg最适添加量对乌鳢生长和免疫功能的影响，为开发水产养殖业中Ala-Gln和Arg的共同使用的免疫添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及饲料

以鱼粉为蛋白源，配制添加Ala-Gln（含量99%，北京莱瑞森医药科技有限公司）和Arg（含量99%，浙江省益万生物技术有限公司）的等氮等能（42.5%粗蛋白质、18.5 MJ/kg）的七组饲料。Ala-Gln和Arg的添加梯度的设置原则是以Ala-Gln和Arg各自对乌鳢生长的最适添加量（5.0 g/kg和20 g/kg）为100%，等比例添加0%、20%、40%、60%、80%、100%、120%（见表1）。饲料原料经粉碎、称重、混均、挤压成直径为1.5 mm的颗粒，晒干后，-20℃保存、备用。采用国标法测定饲料中的水分、粗蛋白质、粗灰分和粗脂肪，饲料配方见表2和表3。

表1 试验设计

1.2 试验设计及饲养管理

试验乌鳢购于辽宁刘二堡渔场，试验前暂养于室内玻璃水族箱中。暂养期间投喂基础日粮（蛋白质含量42%）驯化15 d。选取体质健康、大小一致的乌鳢，体质量为（9.56±0.24）g，试验开始前，停食1 d。随机分配到21个玻璃水族箱中，七个处理，每处理3个重复，每重复30尾鱼。每天09：00、16：00饱食投喂两次。饲养8周，pH值为7.1±0.1，氨氮＜0.5 mg/l，水温为23～30 ℃，溶解氧＞5.0 mg/l。

1.3 样品收集及指标计算

表2 试验饲料（%干物质基础）

表3 试验饲料营养组成（干物质基础）

饲养8周后取样，计算平均增重率、饲料效率、摄食率、蛋白效率及肥满度，取侧线上背鳍下的白肌，用于营养成分的测定。

平均增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0

饲料效率（%）=100×（Wt-W0）/I

摄食率（%/d）=100×I/（W0+Wt）/2t

蛋白效率=（Wt-W0）/（I×C）

肥满度（g/cm3）=（W/L3）×100

式中：I——摄入饲料的重量（g）；

t——试验时间（d）；

W0、Wt——试验初始和结束时乌鳢的总重量（g）；

C——饲料蛋白质的含量（%）；

W、L——每尾鱼的体重（g）和体长（cm）。

1.4 抗氧化酶、免疫酶和细胞因子的测定

饲养8周，停食24 h，每缸随机取10尾鱼，用MS-222（200 mg/l）麻醉，尾静脉采血，4 ℃静置12 h，离心取血清，之后取头肾、脾脏和肝脏，-20℃保存待测。分别采用黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、比浊法、硝酸还原酶法、考马斯亮兰法、双抗体夹心ELISA法、放射免疫分析法测定过氧化物歧化酶（SOD）活性、血清谷胱甘肽过氧化物酶活力（GSHPx）、溶菌酶（LZM）活性、一氧化氮（NO）含量、蛋白含量、血清中IL-1β水平、血清IL-2的含量。

1.5 攻毒试验

试验结束时，每组取60尾，三个平行，采用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），活化后用无菌生理盐水稀释，按100 g鱼体重0.1 ml腹腔注射菌液（菌液浓度为6×109cells/ml，是7 d内鱼死亡一半时的菌液浓度和注射剂量），观察1周，统计乌鳢死亡率并计算其攻毒后存活率。

1.6 统计分析

采用SPSS（20.0）软件进行单因素方差分析，用Duncan's多重比较进行组间差异显著性比较。数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 Ala-Gln和Arg对乌鳢生长的影响（见表4）

由表4可知，饲料中Ala-Gln和Arg添加比例增加到60%时，乌鳢平均增重率显著高于20%组、40%组和对照组（P＜0.05），但Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%时，乌鳢平均增重率不再提高，且各组之间差异不显著。将饲料中Ala-Gln和Arg添加量的比例（X）和试验乌鳢平均增重率（Y）做抛物线回归分析，所得方程为：Y=-76.907X2+110.50X+151.03，R2=0.892 4（Xmax=71.84%）。根据抛物线回归分析结果与方差分析结合起来得出，乌鳢平均增重率在Ala-Gln和Arg添加比例为60%～71.84%时达到最大值，即Ala-Gln最适添加范围为3.0～3.59 g/kg、Arg最适添加范围为12.0～14.37 mg/kg。

表4 Ala-Gln和Arg对乌鳢生长及饲料利用的影响

由表4同时可知，饲料中Ala-Gln和Arg添加比例为20%～60%时，乌鳢饲料效率和蛋白效率随其添加比例的增加而升高，且Ala-Gln和Arg添加比例为60%时，乌鳢蛋白质效率和饲料效率均显著高于对照组（P＜0.05），但是当Ala-Gln和Arg添加比例在80%～120%时，饲料效率和蛋白质效率均不再升高且各组之间差异不显著（P＞0.05）。将Ala-Gln和Arg添加比例（X）和乌鳢蛋白效率（Y）做回归分析为：Y=-0.339 8X2+0.467 3X+2.137 4，R2=0.901 2（Xmax=68.76%）抛物线回归分析结果与方差分析结合起来得出，乌鳢最大蛋白效率的最适Ala-Gln和Arg添加比例为60%～68.76%，即Ala-Gln最适添加范围3.0～3.40 g/kg、Arg最适添加范围12.0～13.75 mg/kg。

2.2 Ala-Gln和Arg对乌鳢肌肉营养成分的影响（见表5）

表5 Ala-Gln和Arg对乌鳢肌肉营养成分的影响（%）

由表5可知，饲料中Ala-Gln和Arg的添加比例在20%～80%时，乌鳢肌肉中粗蛋白质含量随着其添加比例的增加呈上升趋势，而饲料中Ala-Gln和Arg添加比例为80%时，粗蛋白质含量显著高于对照组（P＜0.05），但当Ala-Gln和Arg添加比例为100%和120%时，粗蛋白质含量与对照组及其他试验组差异都不显著（P＜0.05），且二者之间差异不显著。乌鳢肌肉中的粗灰分、粗脂肪和水分各组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 Ala-Gln和Arg对乌鳢抗氧化酶、免疫酶和细胞因子的影响（见表6）

表6 Ala-Gln和Arg对血清和肝脏乌鳢SOD和GSH-Px的影响

由表6可知，血清和肝脏GSH-Px随Ala-Gln和Arg的添加而增加。当60%添加量时，血清和肝脏GSH-Px显著高于对照组，添加120%组血清GSH-Px显著高于20%、40%、60%组和对照组（P＜0.05），添加100%组肝脏GSH-Px显著高于对照组和20%～60%添加组（P＜0.05），与80%和120%添加组差异不显著。血清和肝脏SOD随Ala-Gln和Arg的添加而增加，120%添加组的血清SOD显著高于对照组和20%、40%组（P＜0.05），80%添加组的肝脏SOD显著高于对照组、20%和40%添加组，与60%、100%和120%添加组差异不显著。

Ala-Gln和Arg对乌鳢头肾和脾脏的LZM活性和NO含量的影响见表7。头肾和脾脏的LZM活性都有随Ala-Gln和Arg的添加出现先升高后降低或平稳的趋势，20%添加组的头肾LZM活性显著高于对照组（P＜0.05），40%添加组的头肾LZM活性显著高于对照组和20%添加组（P＜0.05），与60%添加组差异不显著。80%～120%添加组的头肾的LZM活性差异不显著。20%～60%添加组脾脏的LZM活性显著高于对照组（P＜0.05），80%～120%添加组差异不显著；头肾和脾脏的NO含量都随Ala-Gln和Arg的添加量的增加先升后降，60%添加组的头肾和脾脏NO含量都显著高于其他各组和对照组（P＜0.05）。

表7 Ala-Gln和Arg对乌鳢头肾和脾脏LZM活性和NO含量的影响

Ala-Gln和Arg对乌鳢血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影响见表8。IL-1β随Ala-Gln和Arg的增加而降低，60%添加组的IL-1β显著低于对照组、20%和40%添加组（P＜0.05），但与80%～120%添加组差异不显著。IL-2随Ala-Gln和Arg的增加先增加后降低，且在80%添加组达到最大值，各试验组均显著高于对照组（P＜0.05）。攻毒存活率随Ala-Gln和Arg的增加而升高，60%添加组的攻毒存活率显著高于对照组、20%～40%添加组（P＜0.05），与80%～120%添加组差异不显著（表8）。

表8 Ala-Gln和Arg对乌鳢血清PBL的IL-1β和IL-2以及攻毒存活率的影响

3 讨论

3.1 Ala-Gln和Arg对乌鳢生长、饲料利用和营养成分的影响

在饲料中适量添加Ala-Gln，可有效促进动物生长、饲料利用和蛋白质的合成。在德国镜鲤（Cyprinus carpio L.）日粮中添加0.75%Ala-Gln能显著提高其生长、饲料利用和蛋白质的沉积（朱青等，2009）。

Gln可以提高大鼠游离甲状腺素T3和T4含量，通过上调小肠黏膜细胞IGF-ImRNA的表达量以增加IGF-I自分泌和旁分泌，以致促进蛋白质合成，从而提高生长性能（谢建新等，2001）。对军曹鱼（Rachycentron canadum）幼鱼（14.7 g）（赵红霞等，2007）、团头鲂（2.6 g）（廖英杰等，2014）、杂交条纹鲈（Moront Saxatuis）（Chang等，2012）、印度鲶（Kryptoglanis）（Khan等，2012）等的生长起促进作用、蛋白质沉积和免疫力提高的精氨酸含量分别是2.38%（占饲料蛋白的5.17%）、1.81%、1.0%、1.75%。石斑鱼日粮Arg含量在2.01%～3.08%时，肌肉中粗蛋白质含量随着Arg增加而升高（Zhou等，2012）；在斑点叉尾鮰饲料中添加1.5%～2.5%Arg，可见Arg含量与鱼体粗脂肪含量呈负相关，同时与水分含量也呈负相关（Khan等，2012）。在本试验中，Ala-Gln和Arg添加比例为60%添加组和80%添加组比100%添加组（即分别添加Ala-Gln和Arg对乌鳢的最适添加量）效果显著，随着Ala-Gln和Arg添加比例的增加，乌鳢摄食率、蛋白质效率和饲料效率显著提高，说明饲料中添加Arg和Ala-Gln能有效提高饲料蛋白质的利用率，从而促进乌鳢生长。

3.2 Ala-Gln和Arg对乌鳢免疫和抗病的影响

Gln能够有效提高机体抗应激能力，主要表现在营养代谢、提供能量、抑制病菌和抗氧化等方面。Gln二肽可提高日本对虾（Penaeus japonicus）（叶均安等，2009）、哲罗鱼（Hucho taimen）（徐奇友等，2009）的抗氧化能力，缓解应激造成的过氧化损伤，从而利于生长。同时，Gln的免疫调节作用一方面作用于炎症早期，抑制促炎因子TNF、IL-1、IL-6的过多产生，从而避免过强的炎症反应；另一方面可作用于补偿期，促进淋巴细胞增殖及IL-2的产生，避免促炎细胞因子的产生而造成的免疫抑制。此外，T淋巴细胞分泌lL-2及其受体的表达也依赖于外源性Gln的补充（Crawford等，1985）。持续应激时，巨噬细胞内Arg被大量用于NO的生成而导致缺乏，因一氧化氮合酶（NOS）直接催化精氨酸产生NO，Gln可促进NOS基因的表达，Gln可促进巨噬细胞和中性粒细胞分泌NO，间接调节Arg的需求量以致使NO的生成，因此，饲料中必须补充足够的Arg和Ala-Gln。Ala-Gln可显著提高日本对虾血清中的LZM活性（叶均安等，2009）。在团头鲂（2.6 g）饲料中添加2.35%Arg，其幼鱼的免疫力和抗病原菌感染能力均达到最高（廖英杰等，2014）；添加1.0%Arg能显著提高杂交条纹鲈血清LZM活性，显著提高细胞外超氧阴离子和中性粒细胞氧自由基的产生（Chang等，2012）；斑点叉尾鮰接种爱德华氏菌7 d后，添加4%Arg组血清爱德华氏菌抗体效价显著提高，14 d后显著提高对爱德华氏菌的抵抗能力（Pohlenz等，2012）；在日粮中添加2%Arg能显著提高斑点叉尾鲴感染爱德华氏菌后的成活率（Buentello等，2007）。本试验饲料中添加Ala-Gln和Arg可通过影响血清和肝脏的SOD和GSH-Px含量，提高其抗氧化功能，通过影响头肾和脾脏的LZM活性和NO含量以提高其免疫力，通过调节IL-1β和IL-2来提高其抗炎活性，通过影响攻毒存活率来提高抗病能力，具有显著的免疫和抗病保护作用。