刘巍 刘庆庆

摘 要： 微生物种系，是生物学研究的常用材料以及工业生产的重要原料，保持微生物种系的稳定是保证后续实验和生产顺利进行的前提，因此微生物菌种的保藏是微生物研究的一项重要课题。

关键词： 微生物；菌种保藏

0 引言

菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术。其目的是在人工创造的条件下尽量减慢或停止菌种的生长繁殖，使其处于休眠状态，减低菌种的变异率，在较长时期内保持着生活能力，以便为扩大微生物育种及微生物学研究提供大量可靠的优质菌种。菌种的妥善保藏是良好的实验室管理和实验质量的重要保证。标准菌种管理包括：标准菌种来源、菌种管理制度、标准菌种实验要求及注意事项。现就微生物菌种保藏方法做如下探讨。

1 微生物菌种保藏原理

各种微生物菌种保藏方法的主要原理是根据不同微生物的生理生化特点，人为创造缺氧、低温或者干燥的条件，降低微生物的新陈代谢， 使其生命活动基本处于停滞或者休眠状态，停止生长繁殖的微生物，其遗传物质自然会更加稳定。因此微生物的性状在这种条件下保持稳定，达到维持种系的目的。以下介绍的保存方法大致可以分为两类：

（1）在基质中低温的保藏方法，包括斜面、半固体穿刺、石蜡、沙土管保藏法。这类保藏方法通过稍降低温度辅以缺氧及减少养分供给等方式，以降低微生物的新陈代谢，从而达到较长时间保藏菌种的目的。

（2）在保护剂中超低温保藏，也包括真空干燥冻存法。通过保护剂减少溶液结晶， 平衡微生物细胞内外渗透压，保证微生物的生存，同时把温度降低到冰点以下使微生物的新陈代谢完全停止。这类方法虽然操作复杂，要求的硬件条件较高， 但可以实现很长时间保持菌种稳定的目的。

2 微生物菌种的保藏方法

2. 1 定期移植法

亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养（保藏厌氧细菌用）等。将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。保藏时间依微生物的种类不同而不同。此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易于变异。只能作为菌种的短期保藏。

2. 2 液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法。选用优质化学纯液体石蜡，采用以下两种方式进行灭菌：（1）121 ℃湿热灭菌30 min，置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。（2）160 ℃干热灭菌2 h，冷却后，经无菌检查后备用[2]。把液体石蜡注入已长好菌的斜面上并高出斜面顶端1 cm，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温（4～6℃） 干燥处或室温下保存。保藏期间应定期

检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。

此方法简便有效，保藏时间2～10年，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。缺点是必须直立存放，占空间大，不便携带。某些以石蜡为碳源，或对液体石蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。

2. 3 沙土管保藏法

取60～80 目河沙，用吸铁石吸去铁质，用10%盐酸浸泡24h后弃盐酸，用水洗至中性，将沙子烘干备用。取地面下40～60 cm 非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎后100 目过筛并用水洗至中性，烘干备用。将处理后的沙、土按质量比2∶1 混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1 cm 左右，塞好棉塞，121 ℃湿热灭菌30 min，无菌检验合格后方可使用。把制备好的菌悬液分装每支沙土管0.5 mL，放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥剂的容器中，用真空泵抽去水分。抽检合格后封口，存放于低温（4～6℃）干燥处保藏，每隔半年验证1 次。

本法方法简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存两年，但对营养细胞不适用。由于在真空干燥过程中，机械力容易造成孢子的死亡，因此在保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法接种。

2. 4 真空冷冻干燥保藏法

2. 4. 1 好氧菌冷冻干燥管的制备

安瓿管用2%盐酸浸泡过夜，用自来水冲洗并用蒸馏水浸泡至pH 中性，烘干后加入脱脂棉塞，灭菌备用。保护剂可选择血清、脱脂牛奶和海藻糖等。将培养好的菌体或孢子加入保护剂制成菌悬液，分装于安瓿管中，每支0.2 mL。然后放入冰箱冷冻2 h 以上，达到-20～35℃左右。再置于冷冻干燥箱内进行冷冻干燥直至其中水分被抽干，时间一般为8～20 h。将安瓿管在真空条件下熔封，低温或常温保藏。

2. 4. 2 厌氧菌冷冻干燥管的制备

主要程序与需氧菌操作相同，注意保护剂的选择和准备，保护剂使用前应在100 ℃的沸水中煮沸15 min 左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。

此法为菌种保藏方法中应用最广泛的，是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，几乎所有的微生物均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年[2]。方便之处在于因冷冻干燥管无需低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵。

2. 5 冷冻保藏法

2. 5. 1 普通冷冻保藏技术（ - 20℃）

将培养好的固体或液体菌种用橡胶塞封口，置于普通冰箱中保藏。这一方法虽操作简单但不适宜长期保藏。

2. 5. 2 超低温冷冻保藏技术（ -60～- 80℃）

将生长至对数生长中后期的微生物细胞，加入新鲜培养基使其悬浮，然后加入等体积的20%甘油或10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂，混匀后分装入冷冻管或安瓿管中，于-70℃超低温冰箱中保藏。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5 年而活力不受影响。

2. 5. 3 液氮超低温保藏法

主要程序与超低温冷冻保藏技术（-60～-80℃）相同。需注意分装好的安瓿管在放入液氮前需用控速冷冻机预冻，冷冻速率以1℃/min 为宜，冷冻到-35℃。如果无控速冷冻机，可将安瓿管置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。使用时从液氮罐中取出，立即放置38～40℃水浴中使其溶化，而后直接将其接种到适宜的培养基中即可。此法存活率高，稳定性强，保藏时间长，是长期保藏菌种的最好方法。适用于各种菌种的保藏，特别适用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种。此法需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温度。

2. 6 基因工程菌的保藏

2. 6. 1 穿刺保藏法

在容量为2～3mL旋盖玻璃小瓶中加入相当于约2/3 容量的LB 琼脂，灭菌后备用。用接种针挑取被保藏菌株单菌落，针刺至瓶底，在适当温度下培养过夜后避光保藏于4℃或室温。穿刺法可保藏细菌2年之久。

2. 6. 2 甘油管冷凍保藏

在细菌培养物中加入适量甘油（使甘油终浓度为15%），分装至保存管内，置于-20 ℃或-70 ℃冰箱中保藏。此法可保藏1～10 年。

2. 7 固定化技术

固定化的保藏技术是将真菌菌株事先包裹在藻酸钙中并进行超低温保藏的一种保藏技术。首先，制备真菌的孢子或菌丝的藻酸盐的悬浮液，将悬液滴入藻酸钙的溶液中，放置一段时间后，将菌丝或孢子的藻酸钙小球转移到高渗溶液中进行脱水，然后按照菌种保藏的一些常规方法保藏， 如液氮超低温保藏、油管保藏、蒸馏水保藏等。固定化的技术方法已用于真菌酶制剂、生防菌株、生物降解等多个方面的研究。

结语

由于微生物的多样性，每种菌种保藏方法都各有优缺点。根据菌种的生物学特性，科学的保藏菌种并严格按照标准菌种管理制度使用菌种，可以使实验室检验工作得到进一步提升。

参考文献

[1] 吕红线，郭利美.工业微生物菌种的保藏方法[J].山东轻工业学院学报，2007，21（1）：52-55.

[2] 许丽娟，刘红，魏小武.微生物菌种的保藏方法[J].现代农业科技，2008，（16）：99-101.