毕士奇， 吕德明， 杨开元， 戴瑶， 庄琴, 黄秋生， 张志坚， 崔学文

(1. 江苏大学医学院， 江苏， 镇江 212013； 2. 江苏大学附属医院血液科， 江苏 镇江 212001； 3. 江苏大学附属医院耳鼻咽喉科， 江苏 镇江 212001； 4. 江苏大学附属医院骨科， 江苏 镇江 212001)

外胚层间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，EMSCs)是来源于胚胎时期神经嵴(neural crest)的一种多能干细胞，主要分布于头面部黏膜的固有层内。EMSCs不仅保留多向分化潜能而且具有很强的增殖能力[1]。鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜，关于嗅黏膜干细胞和嗅鞘细胞修复中枢及外周神经系统损伤的研究较多，并且取得了令人瞩目的进展。我们以往的研究发现在大鼠和人的鼻腔呼吸黏膜固有层内广泛存在EMSCs，该细胞可同时表达神经外胚层干细胞标志蛋白和中胚层干细胞标志蛋白。与嗅鞘细胞比较，鼻呼吸黏膜来源的EMSCs取材更简便，且不损伤嗅觉功能[2]。EMSCs能够在体外传代和扩增，其扩增代数可达10代，扩增的EMSCs 仍可高表达干细胞标志蛋白。

音猬因子(sonic hedgehog, SHH)是胚胎发育过程中产生的一种多功能因子，在调控神经系统分化中发挥重要作用[3]。有关文献报道，SHH通过Patched-Smoothened-Gli 经典的信号通路，促进神经细胞的突起向 SHH 高浓度区域延伸，并促进神经细胞之间的突触形成[4]。我们以往的研究表明，联合使用全反式维甲酸(ATRA)、SHH、人神经营养因子3(NT3)、脑源性神经营养因子(BDNF)等神经营养因子可在体外诱导EMSCs向神经元样细胞分化[5]；然而，诱导过程需要消耗大量的神经营养因子。如果将EMSCs单独移植到脊髓损伤部位，由于局部缺少高浓度的SHH等神经营养因子，EMSCs的增殖分化能力有限，将影响其修复神经损伤的效率。为了提高脊髓损伤部位SHH浓度，我们课题组选用壳聚糖纳米颗粒作为载体，以京尼平为交联剂交联SHH，然后将SHH缓释纳米颗粒移植至大鼠脊髓损伤处，可促进脊髓损伤修复[6]。由此说明，维持脊髓损伤部位SHH浓度有利于神经再生。

目前中枢神经系统损伤最佳的治疗方法仍是细胞移植[7]。如何在体外寻找与神经组织生物相容性好，可分泌神经营养因子并可自身分化为神经细胞的种子细胞，已成为目前神经科学领域的研究热点。本研究中用SHH基因转染EMSCs，使其能自分泌SHH，并提高其向神经细胞分化的能力。如将该细胞移植到脊髓损伤部位，其既可分泌SHH维持脊髓损伤部位SHH浓度，促进损伤神经的再生，又可诱导自身分化为神经细胞参与神经组织修复。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

清洁级SD大鼠，50～150 g，雌雄不限，由江苏大学实验动物中心提供(合格证号：2211615001)。DMEM/F12培养基、胎牛血清、Neurobasal培养基及B27(美国Gibco 公司)；胰蛋白酶、ATRA、兔抗Smoothen抗体(美国Sigma公司)；兔抗巢蛋白、兔抗Connexin-43、兔抗轴突膜蛋白(GAP-43)、兔抗髓鞘碱性蛋白(MBP)、小鼠抗波形蛋白、小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Cy3和488偶联抗兔、抗小鼠和抗山羊IgG抗体购自博士德生物工程公司；山羊抗SHH和小鼠抗β-3微管蛋白(TUBB3)抗体(美国R&D公司)。SHH-GFP基因重组腺病毒的构建由长沙盈润公司提供技术支持。SHH-GFP引物设计如下，ShhN-gfp-f:AAAGAATTCGCCACCATGCTGCTGCTGCTGGCCAGATGT; ShhN-gfp-r:AAAGAATTCAGATTTGGCCGCCACGGAGTTC。

1.2 SD大鼠EMSCs的分离、培养和纯化传代

颈椎脱臼法处死SD大鼠，头面部用碘伏灭菌后，无菌条件下经鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，显露鼻腔，取出鼻中隔中下部分置于DMEM/F12中，剥离全层鼻黏膜，弃去鼻中隔软骨[8]。PBS漂洗剥离黏膜组织，去除血液。用眼科剪充分剪碎黏膜组织，0.25%胰酶37 ℃消化15 min，置于10% 胎牛血清的DMEM/F12终止消化，离心去上清液。将沉淀的组织块和细胞用10% 胎牛血清的DMEM/F12吹散，接种于培养瓶，置于37 ℃、5% CO2、95%湿度细胞培养箱中培养；7 d 后将培养基和悬浮的组织吸出弃去，并补充新的培养基，每3天换液1次，当细胞密度达80%时进行消化、传代。

1.3 SHH基因重组腺病毒转染EMSCs

将上述第3代EMSCs接种于96孔培养板和6孔培养板内，同时加入浓度为1%的293A细胞扩增的SHH基因重组腺病毒液(具体方法略)，培养3 d后荧光显微镜观察转染情况，当转染率达85%时，用4 ℃预冷的4%多聚甲醛固定96孔板内细胞，对未转染的细胞(EMSCs)及SHH基因转染的细胞(SHH-EMSCs)进行免疫荧光染色。用蛋白质印迹法检测6孔板内EMSCs及SHH-EMSCs细胞内的SHH表达水平和培养液中的分泌型SHH的相对含量。

1.4 免疫荧光染色检测SHH-EMSCs干细胞标志蛋白

将上述4%多聚甲醛固定的EMSCs及SHH-EMSCs用PBS清洗3次，用0.3% Triton X-100 37 ℃孵育30 min，3% BSA 37 ℃孵育1 h，分别加入巢蛋白、波形蛋白、 Connexin- 43抗体(稀释比为1 ∶100)。对照孔加入PBS， 4 ℃孵育8 h，PBS洗3次，加入和第一抗体相应的Cy3标记的第二抗体，37 ℃孵育2 h，PBS清洗，DAPI染核后甘油封片，用荧光显微镜(Zeiss Axio Observer; GmbH, 德国)观察拍照。

1.5 蛋白质印迹法检测细胞及培养液中的SHH蛋白

蛋白样品的收集方法如下：用50 μL RIPA裂解液(含1 μL复合蛋白酶抑制剂)4 ℃裂解6孔板内的细胞10 min，加入等量电泳上样缓冲液混匀后100 ℃煮沸冷却后-80 ℃冷冻备用；收集6孔板内培养基上清液，-20 ℃冷冻后，置于-80 ℃冷冻干燥机中干燥，称取10 mg的冻干粉加入50 μL PBS(含1 μL复合蛋白酶抑制剂)，溶解后加入等量的电泳上样缓冲液混匀后100 ℃煮沸冷却后-80 ℃冷冻备用。蛋白质印迹步骤如下：制备10%的分离胶和5%的积层胶, 以4 μL每泳道上样, 电泳, 转膜，脱脂奶粉封闭1 h，用山羊抗SHH一抗37 ℃孵育2 h, TBST洗膜3次，每次5 min, HRP偶联的二抗孵育1 h, TBST洗膜3次，每次5 min；以ECL-PLUS作为发光剂, 于分子成像系统Typhoon 9400 Imager上扫描蛋白条带并测定其灰度。细胞内蛋白表达的相对水平选用细胞内骨架蛋白β-微管蛋白作为内参。计算各泳道(各组)SHH蛋白条带与β-微管蛋白条带的灰度比值，进行统计学处理。培养基内分泌型SHH含量只作定性观察(培养基内的β-微管蛋白含量极微不适合作为内参)。

1.6 SHH-EMSCs向神经细胞的诱导分化

诱导分化实验分为4组：SHH-EMSCs诱导组、SHH-EMSCs正常培养组、EMSCs诱导组、EMSCs正常培养组。诱导组培养液为含5 % 胎牛血清, 2% B27，ATRA 0.5 μg/mL, TSA 20 ng/mL的Neurobasal培养液,对照组培养液为5% 胎牛血清 Neurobasal培养液。将第3代SHH-EMSCs和EMSCs接种于96和6孔板内, 完全贴壁后，加入诱导或非诱导培养基，3 d后均换为10% 胎牛血清 DMEM/F12完全培养基继续培养4 d。倒置显微镜观察细胞形态的变化。培养7 d后用4 ℃预冷的4%多聚甲醛固定细胞，用GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP的抗体对分化细胞进行免疫荧光染色(染色过程同上)。蛋白质印迹测定细胞内GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP和Smoothen蛋白表达水平(蛋白收集和测定方法同上)。

1.7 SHH-EMSCs的体内移植

SD大鼠麻醉后显露T9-L1棘突及椎板，用特制止血钳咬去T9-T12棘突及椎板。显露脊髓，刺破硬脊膜，微量注射器吸取20 μL SHH-EMSCs悬液(含1×108个细胞)，倾斜60°进针，缓慢注入，注射持续时间为5 min，注射完毕停留5 min退针。术毕，逐层缝合筋膜、肌肉和皮肤。连续肌注青霉素(5万U/kg)3 d，动物手术2周后用4 ℃预冷的4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定，取出脊髓。用30%蔗糖脱水后进行冰冻切片，片厚20 μm，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，2% BSA/0.01% Triton X-100室温作用30 min，以兔抗TUBB3 抗体(1 ∶200)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，然后用Cy3标记的荧光二抗(羊抗兔IgG，1 ∶100) 37℃ 孵育1 h，DAPI染核后，于荧光显微镜下观察细胞在脊髓内存活和分化的情况。

1.8 统计学分析

组内采用

LSD-t检验，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SHH基因转染后EMSCs向神经细胞诱导分化的形态学观察

SHH-EMSCs诱导组培养48 h后, 即可见部分细胞的胞体变圆，两极可见短突起；培养3 d后部分细胞呈多极化。 培养7 d后，EMSCs诱导组可见很少量的神经样细胞，SHH-EMSCs诱导组可见较多神经样细胞。培养14 d后(图1)，SHH-EMSCs诱导组出现较多数量的双突起、多突起等多种形态的神经样细胞，部分突起可连接成网状；EMSCs诱导组出现少量神经样细胞；EMSCs正常培养组未见明显细胞形态学改变。

图1 诱导14 d后各组细胞形态观察(倒置显微镜×100)

2.2 SHH-EMSCs的干细胞标志蛋白及SHH蛋白的表达

原代EMSCs培养3 d,部分细胞开始贴壁生长。继续培养3 d后，贴壁细胞生长较快。培养至第10 d可见大部分细胞呈鱼群样；免疫荧光染色结果显示EMSCs表达巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43,且表达率高达85%(图2)。经SHH基因转染的EMSCs形态无明显变化；免疫荧光染色结果显示SHH-EMSCs仍然高表达巢蛋白、波形蛋白 和Connexin-43, 且表达率高达90%(图3)；免疫印迹数据显示SHH-EMSCs的SHH表达水平明显高于EMSCs(图4A)，并且SHH-EMSCs培养基上清液中可检测到分泌型的SHH(图4B)。

2.3 SHH-EMSCs向神经细胞诱导分化的验证

2.3.1 免疫荧光染色结果 对4组细胞进行免疫荧光染色，可观察到SHH-EMSCs诱导组GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen蛋白呈强阳性，GFAP表达阴性(图 5)。同等曝光量的条件下其他3组细胞GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP和Smoothen蛋白的表达均为阴性(染色结果未列出)。

图2 EMSCs的巢蛋白、波形蛋白及Connexin-43蛋白表达(免疫荧光染色×100)

图3 SHH-EMSCs的巢蛋白、波形蛋白及Connnexin-43(免疫荧光染色×100)

A. 细胞内SHH蛋白，a:P<0.05，与EMSCs组比较；B. 培养上清液中SHH蛋白

图4蛋白质印迹检测SHH蛋白表达

图5 免疫荧光检测SHH-EMSCs诱导组神经细胞分化标志蛋白(×100)

2.3.2 蛋白质印迹结果 SHH-EMSCs诱导组的GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen蛋白表达水平明显高于其他3组(均P<0.01)；EMSCs诱导组与两组未诱导组对比无统计学意义；GFAP在4组细胞中的表达水平均较低且差异无统计学意义(图6)。

b: P<0.01,与其他3组比较

2.4 SHH-EMSCs在大鼠脊髓内的存活及分化情况

SHH-EMSCs移植至脊髓内2周，可见SHH-EMSCs依然存活且已迁移一段距离，并分泌SHH-GFP融合蛋白(绿色荧光颗粒)，移植细胞表达神经细胞标志蛋白TUBB3(红色荧光)，白色箭头所示(图7)。

3 讨论

EMSCs是分布于头面部的特殊类型的MSCs，起源于胚胎时期的神经嵴，EMSCs取材简便、体外增殖能力强，具有多向分化潜能[9]。体外培养的EMSCs可定向诱导为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞[10]。将EMSCs在体外诱导成雪旺样细胞，与神经球样细胞搭载Firbrin胶共同移植到脊髓损伤模型的SD大鼠体内，显示EMSCs可促进神经再生，提示该细胞在中枢神经系统疾病细胞治疗方面具有良好的应用前景[2]。

图7 SHH-EMSCs细胞体内存活及TUBB3蛋白的表达(免疫荧光染色×100)

SHH是哺乳动物信号通路家族中的3种蛋白质之一，它不仅是调节脊椎动物器官发生的形态形成因子, 而且在神经系统的发生和分化过程中具有重要作用[11]。大量研究表明SHH可促进神经干细胞分化为多巴胺能神经元[12]；陈谦等[13]利用SHH联合NT-3成功诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化；研究发现SHH核心受体BOC通过与ABL和JNK激活的相互作用调节神经元分化和神经轴突生长[14]；SHH可促进中枢神经损伤后的修复[15-16]。

本研究结果显示，SHH基因修饰的EMSCs保留了原有的干细胞特性，并增强了向神经细胞分化的能力。GAP-43参与轴突再生[17], TUBB3是神经元微管家族蛋白[18]，GAP-43和TUBB3是经典的神经元细胞表面标志物；MBP是成熟少突胶质细胞标志物并且与髓鞘的脂质膜相互作用而维持髓鞘结构的稳定[19]，GFAP是星形胶质细胞标志物[20]。SHH-EMSCs经过ATRA诱导后，其高表达GAP-43、TUBB3和MBP，但GFAP表达较弱，说明SHH-EMSCs具有神经元样细胞和少突胶质细胞分化的偏向。值得一提的是在本研究中所用的神经诱导培养基，并未加入任何神经营养因子即可实现其神经诱导分化。蛋白质印迹结果表明，SHH-EMSCs细胞中至少存在两种形式的高浓度SHH，即游离型的SHH和胞内型的SHH。游离型的SHH是EMSCs分泌进入培养基的活性形式，可通过与EMSCs自身或周边细胞膜上的受体如BOC，Patched/Smoothen 等结合，调节靶细胞的增殖和分化[21-22]。胞内型SHH是EMSCs内的合成和储存形式[23]，SHH-EMSCs细胞裂解液内的高水平SHH表明，通过腺病毒染的SHH基因可在EMSCs内高表达，并能分泌到胞外。体内实验结果表明移植到脊髓内的SHH-EMSCs可长时间存活，并分泌SHH-GFP融合蛋白。由此提示，SHH-EMSCs移植到脊髓内可提高损伤脊髓局部的SHH浓度，改善脊髓损伤部位的微环境，有利于神经再生。

综上所述，SHH基因修饰的EMSCs具有较强的向神经样细胞分化的潜能，有望成为移植治疗脊髓损伤的一种新的种子细胞。