罗祖强，庄志泉，涂晓萌

1.温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州 325000；

2.温州医科大学第一临床医学院医学影像学系，浙江 温州 325000；

3.温州医科大学附属眼视光医院中心实验室，浙江 温州 325000

原发性胆囊癌（primary carcinoma of the gallbladder，PCG）是指发生于胆囊底部、体部及颈部的恶性肿瘤。PCG由奥地利学者Stoll在1777年发现，该肿瘤是肝胆外科较常见的胆道恶性肿瘤，居胆道恶性肿瘤首位，居消化道肿瘤第5～6位［1］。PCG的发病率呈逐年升高趋势，在我国PCG的发病率己成为中国发病率增长较快的几种肿瘤之一［2］。从病理学角度来看，大多数的PCG为腺癌，男女比例约1∶3，由于PCG临床经过较为隐秘，大多数患者确诊时多数已进展至晚期，5年生存率不足5%［3-5］。寻找有效的早期诊断及判断PCG预后的方法已成为研究PCG的热点。众所周知，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子家族(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)发挥负向调控细胞周期的作用，p57KIP2是最新发现的一个成员。本研究收集有完整资料的PCG患者，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）、免疫组织化学方法分别检测PCG、胆囊腺瘤（adenoma of the gallbladder，AG）和慢性胆囊炎（chronic cholecystitis，CC）组织中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白的表达并探讨其临床意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集温州医科大学附属第一医院病理科2006年1月—2016年12月存档的PCG标本60例，年龄25～75岁，中位年龄53岁。按美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）癌症分期手册（7版）［6］对PCG进行TNM分期：I期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ+Ⅳ期24例；按WHO标准（2003版）对PCG进行组织学分级：I级13例，Ⅱ级29例，Ⅲ级18例。留取新鲜组织存入液氮中备用，所有组织在固定后做石蜡包埋并切4 μm厚度的切片。同时收集AG 20例和CC 20例作为对照组。

1.2 试剂

PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。鼠抗人p57KIP2抗体、兔抗人cyclin D1抗体、兔抗人cyclin E抗体及其他配套试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。3种抗体的工作浓度分别为1∶150、1∶250和1∶200。

1.3 方法

1.3.1 RTFQ-PCR检测p57KIP2、cyclin D1及cyclin E mRNA的表达情况

β-actin上游引物：5'-CTGGGACGACATGG ACAAAA-3'，下游引物：3'-AAGGAAGGC T G G A A G A G T G C-5'。 p 5 7KIP2上 游 引物：5'-A A C C C G A C G C A G A A G A G TC-3'，下游引物：3'-AGAGGAGAGGA CAGCGAGAAG-5'。Cyclin D1上游引物：5'-AGGAGAACAAACAGATCA-3'，下游引物：3'-TAGGACAGGAAGTTGTTG-5'。Cyclin E上游引物：5'-TTCTTGAGCAACACCCTC-3'，下游引物：3'-CGCATACACTGTCTACCT-5'。用TRIzol提取组织总RNA，取1 μg的总RNA反转录，条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。p57KIP2的PCR条件为：95 ℃ 预变性2 min，95 ℃ 变性45 s，63 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。Cyclin D1的PCR条件为：95 ℃ 预变性2 min，95 ℃ 变性45 s，61 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，共40个循环。Cyclin E的PCR条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40个循环。取10 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR的扩增长度应为180（β-actin）、220（p57KIP2）、163（cyclin D1）和260 bp（cyclin E）。

1.3.2 免疫组织化学检测p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白水平

按实验说明书进行EliVision法染色，以PBS代替一抗为阴性对照，用已知阳性的切片作阳性对照。

1.4 结果判断

1.4.1 RTFQ-PCR结果判定

用BioRad Gel-2000图像分析仪进行光密度分析，以每个标本的目的条带测定值与β-actin测定值的比值，表示该标本目的基因的相对表达水平。

1.4.2 免疫组织化学结果判定

两名病理医师采用双盲法对染色结果进行判断，p57KIP2、cyclin D1及cyclin E以细胞核呈褐色或黄色为阳性细胞。未见阳性细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，褐色为3分。阳性细胞百分比与着色强度相加，（-）示0～1，（+）示2分，（++）示3～4分，（+++）示＞5分，其中（+）～（+++）为阳性，（-）为阴性。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料比较采用方差分析；计数资料采用χ2检验及Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RTFQ-PCR检测p57KIP2、cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC组织中的表达

p57KIP2mRNA在PCG、AG和CC中的表达逐渐升高，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Cyclin D1和cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表达逐渐降低，PCG与AG比较、PCG与CC比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 免疫组织化学检测p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG、AG和CC组织中的水平

p57KIP2蛋白在PCG、AG和CC中的表达逐渐升高，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05，表2、图1A、B）。Cyclin D1和cyclin E蛋白在PCG、AG和CC中的表达逐渐降低，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05，表2，图1C、D）。

表 1 p57KIP2, cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表达Tab. 1 mRNA expressions of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC(±s)

表 1 p57KIP2, cyclin D1及cyclin E mRNA在PCG、AG和CC中的表达Tab. 1 mRNA expressions of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC(±s)

★: P＜0.05, compared with three groups; ▲: P＜0.05, compared with PCG; ●: P＜0.05, compared with AG

Group n p57KIP2 mRNA P value Cyclin D1 mRNA P value Cyclin E mRNA P value PCG 60 0.24±0.03 0.030★ 0.90±0.03 0.028★ 0.74±0.05 0.047★AG 20 0.49±0.01 0.025▲ 0.38±0.02 0.046▲ 0.41±0.03 0.049▲CC 20 0.81±0.04 0.016▲● 0.29±0.02 0.033▲ 0.22±0.01 0.024▲

表 2 p57KIP2，cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG、AG和CC中的水平Tab. 2 Protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG, AG and CC

图 1 p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG和CC中的水平Fig. 1 Protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG and CC

2.3 p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白水平与PCG临床病理特征的关系

在PCG组织中，p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白水平与年龄、肿块大小无关（P＞0.05）。p57KIP2蛋白水平与临床分期、组织学分级及淋巴结转移有关（P＜0.05）。Cyclin D1蛋白水平与临床分期有关（P＜0.05），与组织学分级无关（P＞0.05）。Cyclin E蛋白水平与临床分期、组织学分级无关（P＞0.05，表3）。

表 3 p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白在PCG组织中水平与临床病理特征的关系Tab. 3 Relationship between protein levels of p57KIP2, cyclin D1 and cyclin E in PCG and clinicopathological characteristics

2.4 PCG组织中p57KIP2、cyclin D1及cyclin E蛋白水平的相关性

在PCG中，p57KIP2与cyclin D1的表达呈负相关（χ2=22.143，r=-0.684，P＜0.05）；p57KIP2与cyclin E的表达呈负相关（χ2=21.159，r=-0.475，P＜0.05）；Cyclin D1与cyclin E的表达呈正相关（χ2=9.637，r=0.362，P＜0.05）。

3 讨 论

在细胞有丝分裂过程中，G1到S期有一个限制点，此限制点限制细胞的分裂。p57KIP2是CIP/KIP家族的成员，能阻滞细胞周期通过这个限制点，从而抑制细胞增殖［7-8］。Zhao等［9］的研究显示，抑制乳腺癌细胞中p57KIP2基因的表达，能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭能力。Ru等［10］运用免疫组织化学及PCR方法检测显示，p57KIP2mRNA、蛋白在胃腺癌组织中的表达比正常胃组织低，p57KIP2的表达与胃癌的预后有关。本研究结果显示，p57KIP2mRNA及蛋白在PCG、AG和CC中的表达逐渐升高，两两比较差异有统计学意义（P＜0.05），与上述研究的结果相似。提示正常胆囊组织恶变过程中p57KIP2表达在衰减，从而失去对细胞增殖的负向调控作用。在PCG不同分化程度、临床分期及淋巴结是否转移的检测中p57KIP2的表达差异均有统计学意义（P均＜0.05），提示PCG中p57KIP2可能解除了对细胞生长的抑制，导致细胞无限增殖。因此，p57KIP2在PCG中的检测可作为患者预后的参考指标。

G1期细胞增殖信号的关键蛋白cyclin D1蛋白包含295个氨基酸残基，cyclin D1与CDK4结合，使包括Rb在内的底物磷酸化，促进细胞越过G1/S限制点。Cyclin E蛋白包含395个氨基酸残基，cyclin E与CDK2结合，使包括Rb在内的底物磷酸化，导致细胞从G1晚期进入S期。Doval等［11］研究发现，cyclin D1在PCG中高表达，在淋巴结转移组、高组织学分级组表达更高，cyclin D1是PCG预后的指标之一。张桂东［12］通过RTFQPCR研究cyclin D1 mRNA在PCG与CC中的表达情况，结果显示，cyclin D1 mRNA在PCG组织中的表达高于CC组织，但与组织学分级、淋巴结转移无关。Mishra等［13］应用免疫组织化学检测了40例PCG组织和6例AG织中cyclin E的表情况，结果显示，cyclin E在PCG中表达更高，cyclin E高表达可作为预测胆囊恶性肿瘤侵犯行为的生物标志物。本研究结果显示，cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白在PCG、AG和CC中的表达逐渐降低（P＜0.05）。在PCG组织中，cyclin D1蛋白的表达与临床分期有关（P＜0.05），与组织学分级无关（P＞0.05）。Cyclin E蛋白的表达与临床分期、组织学分级无关（P＞0.05），与上述研究的结果相似。对cyclin D1与cyclin E的相关性分析发现两者呈正相关（P＜0.05），提示cyclin D1、cyclin E高表达能促进PCG细胞的增殖、侵袭与转移，促进PCG的发生、发展，是PCG恶性转变的重要标志。

细胞周期调控是十分复杂的，而肿瘤的产生是多种因素作用的结果。细胞周期的调控中CDKI与cyclin、CDK相互拮抗又相互联系。本研究结果显示，p57KIP2在CC中表达最高，cyclin D1、cyclin E在CC中表达最低，p57KIP2与cyclin D1及cyclin E呈负相关，cyclin D1与cyclin E呈正相关。提示转录、翻译中p57KIP2高表达，cyclin D1及cyclin E低表达是胆囊细胞保持正常沉默状态所必需的前提条件。p57KIP2蛋白与cyclin D1、cyclin E-CDK4复合物结合，抑制Rb蛋白的磷酸化，抑制细胞的分裂。PCG形成中可能由于p57KIP2基因活性下调，使p57KIP2蛋白表达降低，cyclin D1和cyclin E基因活性上调，使cyclin D1、cyclin E蛋白水平升高，削弱了p57KIP2抑制cyclin D1、cyclin E的作用，促使肿瘤形成。

综上所述，p57KIP2表达的降低与cyclin D1、cyclin E表达的增加可能是PCG发生机制之一；检测p57KIP2、cyclin D1及cyclin E对PCG的预后判断有重要意义。