范大勇,姚佳烽,刘彬彬,徐梓菲

(1.东南大学建筑设计研究院有限公司,南京 210096;2.南京航空航天大学机电学院,南京 210016)

近年来,随着精密加工技术越来越成熟,应用于生物医学检测的微流控芯片也开始快速发展,为细胞的检测提供了新思路[1]。目前应用在细胞检测的方法包括免疫荧光法、细胞的电化学分析法、单细胞质谱分析法等。免疫荧光法通过测定荧光物质发射的荧光强弱来定量分析,该方法具有灵敏度高、选择性高等优点,但是检测前需要对细胞进行标记[2],从而会影响细胞的机能。细胞的电化学分析法通过分析细胞在溶液中的电化学性质来分析溶液中细胞的种类,但是不能得到细胞的位置信息。单细胞质谱分析法是通过对细胞在离子源中产生的离子束分析,可以确定细胞的质量,但是检测速度低[3]。电阻抗成像检测技术相比于其他几种细胞检测技方法,不但可以快速的检测细胞的种类和位置,还具有非侵入免标记的优点。

细胞在电检测中得到的电阻抗包含电阻和电容两种成分,并且不同种类的细胞包含不同的阻抗信息[4]。电阻抗成像技术是利用了测量场域内部电导率的差异来进行成像[5]。其基本方法为通过被测量场域表面的电极对注入安全的交流电流,测量其余电极对在该交流电场内的交流电压,之后利用成像算法通过测量值来重构场域内部电导率分布图像。由于输入电流的电流值以及频率范围是安全的,且得益于目前计算机速度的飞速发展,故电阻抗成像检测技术具有安全无辐射、成像速度快等优点,是一种新兴的细胞检测技术[6],并拥有广阔的研发前景。由于微尺度下电阻抗成像检测设备尺寸小且加工不易,噪声对电极采集的信号具有较大影响,所以对微尺度电阻抗成像检测芯片的设计还很少。Yang Y等[7]开发出了直径15 mm的微流控芯片,由16个电极组成电极阵列,可以对培养皿中的细胞进行三维实时成像,而且该设备也可用于对人体组织的检测。Sun等[8]采用PCB技术开发出直径4 mm的微流控芯片,可以对单细进行胞成像。然而由于结构限制,这些设备都不支持流动状态下的细胞检测。

本文设计一种用于可流动状态下细胞电阻抗成像检测的多电极阵列微流控芯片。该芯片可以对静止状态下的细胞和流动状态下的细胞进行电阻抗成像检测。仿真软件模拟结果显示,电极对内部细胞的位置变化比较敏感,可以通过电极所测量的电压变化计算出细胞的空间分布。

1 多电极阵列微流控芯片的结构设计

电极阵列作为微流控芯片的核心,要根据使用环境设计适宜的尺寸及结构。本文设计的多电极阵列微流控芯片需要考虑如下方面:微流控芯片要保持内部多相流的流动性以满足不同细胞的混合;实现多个截面的电阻抗成像检测;芯片与测量仪器接口的设计;芯片的固定。

图1 多电极阵列微流控芯片外观示意图

微流控芯片的整体结构如图1所示,包括PCB板、集成阵列电极的微流道及接口等。芯片通道入口选用“Y”型,方便不同种类细胞的混合和分离。芯片主通道上分布3个多电极阵列截面,用于主通道内部的电阻抗成像检测。PCB板中印刷了芯片所需的电路,电极通过分布在PCB板两侧的插针接口与其他仪器进行信号传输,芯片的基板则通过螺钉和固定板固定在PCB板中。

1.1 微流体通道整体设计

微通道是芯片的核心,微通道结构决定了通道内流体的运动[9]。微通道包含流体出入口、备用出入口、主辅通道等。以细胞的分离和检测为例,细胞液和悬浮液分别从不同的入口注入主通道,经过主通道检测和分离后不同种类的细胞液从不同的出口流出。

本着简单微加工方法和实际运用操作可行的原则,以及满足不同种类细胞混合的要求。本文设计的微流体通道的入口和出口设计成“Y”型,结构如图2所示。芯片的整体长度为L3=20 mm,宽度W=10 mm。主通道借助四路支路通道达到与样品池关联的目的。细胞液及悬浮液分别经过入口A和入口B进入,在主通道处理之后,不同种液体分别从出口C、D流出。支路通道A、B、C、D的直径相同为100 μm,长度为L1=3 mm。电极位于主通道的侧壁上,每个电极截面间距S=3 mm。主通道的长度为L2=10 mm。

图2 微通道平面的CAD设计图(单位:mm)

1.2 微流体通道横截面设计

微通道要保持内部多相流的流动状态为层流,实现细胞在微通道中的有序排布。在粘性力远大于惯性力,或者雷诺数Re≤2 300时处于层流状态。在微通道中处于层流状态下的流体可以借助N-S方程得知流体压力损失情况。雷诺数方程和N-S方程具体公式为:

Re=ρvd/μ

(1)

式中:ρ和μ分别为流体密度和动力粘性系数(N·s/m2),v和d分别为流场的特征速度(m/s)和特征长度。从式(1)得知,通道特征长度d越小,雷诺数Re越小。

在宏观流体运动学中,常借助比表面积对流体流动性进行衡量。对于型腔截面形状来说,比表面积表示的是型腔表面积与体积的比值。在微尺度通道之中,对于长度一致的微流道来说,比表面积衡量的是截面周长比截面面积。如图3所示,横截面为圆形的流道的比表面积为40 mm-1,横截面为菱形的流道的比表面积为56.56 mm-1。由于微流体中流动长度与比表面积表现出了反比关系[10],圆形相比于菱形具有更小的比表面积,其流动长度更大。所以,可以选择截面为圆形的微流道。微流体相比于宏观状态下的流体,在进行流动时有微尺度效应,该效应使得微流体表面力效用增强,黏性力比惯性力大很多。因此有利于微通道内流体保持层流状态,便于实现细胞的介电泳分离。

电阻抗成像中图像重构时,电极采集数据的精度影响图像重构的质量。微通道截面电极不同的结构、数量和排布方式会产生不同的电势分布。先前的研究考虑到微流控芯片的加工工艺,电极排布到菱形微通道的两侧(图3(a)),这种排布方式中利用8个电极实现了电阻抗成像检测[11]。本研究采用圆形横截面,电极数目为8电极、12电极与16电极,电极的排布方式及尺寸如图3(b)所示。

图3 微通道不同截面形状及尺寸(单位:mm)

1.3 电极和芯片材料选择

微电极是微流控芯片的核心部件,通过电信号来检测细胞的阻抗,以及通过施加电压之后所产生的电场来操控细胞的运动。由于电极对于电场的灵敏性要求很高,所以其导电特性对于内电场大小及分布有很大的影响[12]。在生物监测的微流控芯片设计上,电极在选择时需要考虑:导电性能、抗腐蚀性能、加工工艺以及生物相容性。通过对各种常见的电极材料比较,最佳的材料是铂金(Pt),主要是由于其具有延展性好、熔点高、导热导电性能好、化学性质极其稳定、不溶于强酸强碱以及具有独特的催化作用,符合微流控芯片电极的设计要求。

微流控芯片的流道部分可以使用的材料比较多。例如玻璃、单晶硅、石英及有机聚合物等。考虑到芯片需要耐高温、抗化学反映、流道的疏水性以及极低的电导率。对能够使用的各种材料进行了对比得知,聚二甲基硅氧烷(PDMS)不仅满足以上所有要求,同时还具有高分子材料的优势,不会有永久性破坏,与芯片材料的要求非常一致;同时可以实现与自身及硅等材料的可逆结合。本文选取PDMS为芯片制作材料。

1.4 芯片加工方法

选用PDMS作为微流控芯片材料,制作当中可以采用的技术非常多。例如热压成型法、模塑法及刻蚀法等。热压成型法是指在加热并同时加压的条件下,使材料成型并烧结成制品。特点是工艺成熟,可以得到致密度很高的制品,但不适合于制作微流控芯片内部的多电极阵列。刻蚀法是指按照设计要求对材料表面进行选择性腐蚀或剥离,具有分辨率高的优点。模塑法首先借助多种技术(例如刻蚀法)加工出阳膜,之后进行高分子聚合物的浇筑和固化,再把材料剖离就得到我们想要的芯片。本文采用模塑法分层加工芯片,自下而上根据每层所需的PDMS和Pt加工出完成的芯片,借助该方法能够完成相邻通道距离仅仅为0.3 μm的结果。这种方法制作简单,能够进行批量制作、成本低、周期短且对环境没有特殊要求。

2 芯片设计仿真分析

2.1 仿真条件和算法

由上文分析可知,微流道的设计重点在于横截面内电极排布的设计,故对该包含电极的横截面建立仿真模型并进行优化分析。仿真模型主要包括通道、电极、细胞及蒸馏水4个部分。用一个直径为D3=10 μm的圆来代替细胞,其电导率为σ细胞=10-3S/m,相对介电常数为ε细胞=83。电极材料为铂金(Pt),电导率σ电极=8.9×106S/m,分布在通道两侧,通道溶液材料设置为蒸馏水,电导率σ水=5.5×10-6S/m,相对介电常数为ε水=78。在仿真过程中分别针对8电极、12电极、16电极以及菱形8电极进行仿真计算。电极等间距分布在微通道的边界上,对相邻电极施加激励电压U=1 V,同时采集相邻电极之间的电位差。

根据麦克斯韦方程和电磁场理论,对假设仿真模型内部敏感场为似稳场且内部没有激励源。在检测区域内无电流源存在,则敏感场的数学模型为:

·J=0

(2)

场域内电阻率分布σ与电位分布Ф所满足的微分方程为:

·(σФ)=0

(3)

敏感场满足边值条件:

σ∂Ф/∂n=J

(4)

Φ=Φ0

(5)

式中:J为边界上外加激励的电流密度,无注入电流时为零;n为场域外法向单位向量;Φ0为边界上的电位。

图像重建算法作为EIT逆问题求解的核心问题被广泛研究,在此次仿真计算中采用广义矢量模式匹配法(GVSPM)经行图像重建。该算法的表达式如下:

(6)

式中σk是第k次迭代计算后获得的电导率,J是雅可比矩阵,U是仿真模型中电极电位进行正规化后的值。

2.2 仿真结果分析

对应图3设计出来的几种横截面,采用计算机仿真方法进行了细胞检测能力对比。在仿真过程中,对3个细胞组成的细胞群穿过微通道时,微通道内截面进行仿真分析。图4为不同电极传感器仿真模型图与通过广义矢量模式匹配法(GVSPM)图像重构算法经行图像重建之后的结果图的比较。亮色代表高电导率的细胞群,暗色部分代表的是低电导率的蒸馏水。

图4 图像重建模型和仿真结果

为了对仿真结果与仿真模型之间的相关性定量分析,本文引进参数:图像相关性IC

(7)

相邻电极激励模式能够在相同电极数目的情况下获得更多的独立数据,但是激励电流主要分布管道边缘,管道边缘成像分辨率较高,管道中心部分成像分辨率较低。与圆形管道相比,在相同电极数时,电极均匀分布在菱形管道边缘会使得细胞群位置更靠近管道边缘,提升管道中心部分成像质量。但是当细胞群位置靠经菱形管道边角时,电位分布不规律,成像质量会迅速下滑。在图5中,圆形管道传感器所得图像相关性随着细胞群中心与管道中心距离的增加而增加。菱形传感器D-8成像质量不稳定,当细胞群位置靠近电极时,成像质量严重下降。细胞群中心位置在变化过程中,不同电极传感器得到的图像重建质量各有优劣,16电极传感器成像图像相关性的平均值以及极差要优于8电极和12电极传感器。

图5 不同电极传感器图像相关性与细胞群 中心位置的关系

图6给出的是细胞群中心在相同位置处,不同电极传感器图像相关性的比较。图6(a)为细胞群中心位于管道中心位置时,圆形12电极传感器成像质量优于其他类型电极传感器。对于圆形管道截面,当电极数目增加时,能够采集更多的测量数据,从而提高图像重建质量。电极数目的增加也会扩大有用信号的动态范围,在测量精度和计算次数一定时会使成像质量下降,成像效果会随模型位置的不同在更大的范围内变化。图6(b)为细胞群中心距管道中心距离0.01 mm处,不同传感器成像的图像相关性比较。在选定的两个位置处,菱形8电极传感器成像质量都要优于圆形8电极传感器。圆形传感器的成像质量随着电极数目的增多逐渐增强,16电极传感器成像质量会高于8电极和12电极传感器。图6(c)为细胞群中心距离管道中心0.02 mm处成像质量的比较,此处各电极传感器成像的图像相关性较为接近。图6(d)为细胞群中心距离管道中心0.035 mm处成像质量的比较,菱形8电极传感器成像质量严重下降,说明菱形电极传感器成像质量不稳定。由于微流控芯片不仅用于成像,还用于细胞的分离,在细胞的分离过程中细胞逐渐趋近微流道内壁。微流道内壁部分成像质量相比于其他位置成像质量更加重要,结合电极传感器成像图像相关性的平均值分析。圆形电极传感器中,16电极传感器成像质量普遍优于8电极传感器和12电极传感器。

图6 不同电极传感器在相同细胞群中心 位置时的图像相关性

电极越多,可以增加分辨率,提高成像质量。由于受空间限制,过多的电极导致又导致电极尺寸的减小,导致两电极间采集的信号微弱,减低了信号的敏感性,同时,过多电极也会大大降低采用速率,导致成像速度慢。因此,本文设计的微流控芯片传感器选用圆形横截面16电极传感器。

设计出来的16电极阵列微流控芯片突破了传统微流路尺寸的设计技术限制,能够将多电极阵列于流路周围,扩大了微流路的管道直径,不仅能够实现电阻抗成像检测吗,而且在细胞分离方面,可以充分利用介电泳力,在不减少介电泳力(Dielectrophoretic force)的条件下增大了细胞的流动量,大大提高了细胞的分离速度。

3 结论

微流控芯片中电阻抗成像不仅可以观察到细胞的分布,还可以对细胞分离起着指导作用。本文设计了一种用于实现细胞电阻抗成像检测的多电极阵列微流控芯片,并采用数值仿真方法对设计出来的微流控芯片进行了对比分析,并得到了最优方案。具体结论如下:

①对微流控芯片进行整体设计,采用嵌入8,12和16电极的圆形横截面,并与菱形横截面进行了对比讨论。

②在芯片材料选择上主要考虑透光性、生物兼容性、加工工艺等因素,综合各种因素,最后选择了采用PDMS制作芯片。在电极材料选择上主要考虑导电性能、抗腐蚀性能、加工工艺等因素,最终选择物理和化学性能都很稳定的铂金(Pt)。

③运用数值计算方法建立了微流道内细胞群模型,并对主通道横截面内的电场分布进行了计算,对不同的细胞位置在不同类型的电极横截面中成像质量进行了对比分析。最终选择含有16电极的圆形横截面微流控芯片作为最优结构。

该研究对大流量细胞分离和检测微流控芯片的设计提供了思路与一定的理论参考,可以实现3D微尺度细胞电阻抗成像检测与特异细胞的介电泳分离。