刘洋　白晓智　李小强　陈子阅　何亭

[摘要] 目的 探讨负压封闭引流（VSD）治疗C57BL/6J烧伤脓毒症小鼠的效果。 方法 选取雄性C57BL/6J小鼠300只，建立烧伤脓毒症小鼠模型；取造模成功的80只烧伤脓毒症小鼠按照随机数字表法将其分为实验组和对照组，每组各40只。实验组创面处理并采用VSD治疗，接负压治疗仪，调节负压为-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；对照组仅创面处理，每隔24 h更换敷料一次。统计两组创面细菌荧光强度，创面皮肤血流量情况，白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子水平，观察7 d累计生存率。 结果 治疗前，两组的创面荧光强度相似，差异无统计学意义（P > 0.05）；與治疗前比较，治疗24 h后对照组荧光信号强度显著升高（P < 0.05），实验组荧光强度降低（P < 0.05），且两组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。与治疗前比较，对照组经治疗第1、2天有所降低，第3、5、7天后陆续升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；实验组治疗第1、2、3、5、7天小鼠背部创面血流量逐渐增加且明显高于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。经治疗，实验组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量较对照组明显减少，IL-8含量较对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P < 0.05），IL-10含量变化不明显（均P > 0.05）。从第2天开始，实验组生存率明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 VSD治疗C57BL/6J烧伤脓毒症小鼠，可降低创面细菌含量，改善血液供应，降低脓毒症的全身炎性反应水平，提高生存率。

[关键词] 负压封闭引流；烧伤脓毒症；C57BL/6J小鼠；炎性反应

[中图分类号] R644 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）11（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of vaccum sealing drainage （VSD） on C57BL/6J mice with burn sepsis. Methods A total of 300 male C57BL/6J mice were used to establish the model of burn sepsis. Eighty burned sepsis mice successfully were divided into experimental group and control group according to random number table， 40 mice in each group. In the experimental group， the wound was disposed and treated with VSD， the negative pressure apparatus was connected， and the negative pressure was adjusted to -120 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）. In the control group， only wound treatment was performed， and dressing was replaced every 24 h. The fluorescence intensity and blood flow of wound skin， the levels of inflammatory cytokines such as IL-1β， IL-6， IL-8， IL-10， TNF-α and so on were statistically calculated in the two groups， and the cumulative survival rate of 7 d was observed. Results Before treatment， the fluorescence intensity of wound was similar between the two groups， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with before treatment， the fluorescence intensity of the control group increased significantly after 24 h of treatment （P < 0.05）， while the fluorescence intensity of the experimental group decreased compared with before treatment （P < 0.05）. The difference between the two groups was statistically significant （P < 0.05）. Compared with before treatment， the control group showed a decrease on the 1st and 2nd day after treatment， and an increase on the 3rd， 5th and 7th day after treatment， there were statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. The blood flow to the wounds on the back of the experimental group gradually increased and were significantly higher than those of the control group after treatment （P < 0.05 or P < 0.01）. In the experimental group， the contents of pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-6 and TNF-α were significantly reduced and IL-8 was significantly increased compared with the control group （all P < 0.05）， while the changes of IL-10 were not significant （all P > 0.05）. From day 2， the survival rates of the experimental group were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Conclusion VSD treatment for C57BL/6J mice with burn sepsis can reduce bacteria content of wounds， improve blood supply， reduce systemic inflammatory response level of sepsis and improve survival rate.

[Key words] Vaccum sealing drainage； Burn sepsis； C57BL/6J mice； Inflammatory response

据统计[1-2]，全世界每年有超过1800万严重脓毒症病例，且每年以大于1.5%的速度递增，而重度烧伤是脓毒症最常见的发病原因之一。尽管现代重症救治的技术水平在不断发展进步，但目前烧伤脓毒症仍是重度烧伤患者后期死亡的主要原因之一，也是临床烧伤治疗的瓶颈与难题。因此，有效预防和治疗烧伤脓毒症一直是國内外烧伤领域研究的热点。

负压封闭引流（vaccum sealing drainage，VSD）技术是近年来兴起的一种促进创面愈合的前沿技术，是将创面用聚乙烯醇材料覆盖并用半透膜封闭，最后与中心负压或负压泵连接使创面保持相对的负压封闭环境，通过引流管将创面中组织间隙中的渗出液排出体外。VSD能减轻局部组织水肿，增加创伤周围血液流量，清除创面细菌，促进肉芽组织形成并加速创面愈合[3-6]，可用于烧伤创面感染的早期治疗。即使应用VSD治疗，临床上仍有一些烧伤脓毒症患者发展为难以控制的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），最终导致患者死亡。烧伤脓毒症的全身炎性反应问题是亟待解决的重大科学问题。本研究采用VSD治疗C57BL/6J烧伤脓毒症小鼠，观察其细菌量、血流及炎症因子的变化，统计其生存率，以期为提高烧伤脓毒症的治疗效果、探讨其作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取8～12周龄的SPF雄性C57BL/6J小鼠300只[空军军医大学西京医院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2016，合格证号：20160809]，体重18～20 g。饲养在20～25℃室温，湿度50%的环境中，自由饮食，适应性饲养1周后用于后续实验。本研究经陕西省实验动物伦理委员会审批同意。

1.2 方法

1.2.1 烧伤脓毒症小鼠模型的建立 腹腔注射1%苯巴比妥钠1 mL，麻醉成功后，固定小鼠，剪除待建模区域毛发，再用10%硫化钠脱去残余毛发，直至背部皮肤完全暴露。在小鼠背部脱毛区正中部位，以脊柱为中线，放置1个内径2 cm的圆柱状钢化模具，用钳夹固定圆柱状模型于小鼠背部，熨烫蒸汽机开机，温度调至100℃，将模具与小鼠背部皮肤紧密贴合后，将蒸汽喷头放入烫伤模具，蒸汽喷头与皮肤保持1 cm的距离，温度95～98℃，持续烫伤5 s，即可形成1个直径2 cm的Ⅲ度烫伤圆形创面，通过局部创面注射野生型铜绿假单胞菌（ATCC27853），即建立烧伤脓毒症小鼠模型。12 h后检测小鼠的创面、各脏器，均存在细菌即为造模成功。300只实验动物最终成功制备80只烧伤脓毒症模型，余下均因烧伤后感染死亡。

1.2.2 治疗方法 造模结束24 h后，再次对小鼠行麻醉，待麻醉成功后，消毒术区后，切除小鼠烫伤部位的坏死痂皮，并用1%过氧化氢溶液、0.2%呋喃西林和无菌生理盐水依次蘸洗创面；完成对模型小鼠的切痂处理后，将80只烧伤脓毒症小鼠按照随机数字表法将其分为实验组和对照组，每组各40只。其中实验组将按创面形状剪裁好的医用聚氨酯泡沫（施乐辉医用产品公司），覆盖在创面上方，将剪有侧孔的一次性医用引流管的一端置入聚氨酯泡沫中，用生物半透膜（施乐辉医用产品公司）将聚氨酯泡沫和创面一起封闭，然后接负压治疗仪（施乐辉医用产品公司），调节负压为-120 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）持续负压吸引；对照组按创面形状剪裁医用聚氨酯泡沫敷料覆盖创面后，用生物半透膜封闭创面，每隔24 h更换敷料一次。两组小鼠均单笼饲养并观察。

1.3 观察指标

1.3.1 创面细菌荧光强度检测 分别于实验24 h后，用IVIS 2000小动物活体成像系统（Caliper Life Science公司，美国）检测模型动物创面标记菌的荧光强度，以反映小鼠创面铜绿假单胞菌定殖情况，强度越强，提示烧伤创面铜绿假单胞菌含量越高。

1.3.2 背部创面皮肤血流量情况 采用PeriFlux 5000多普勒血流成像仪（Perimed公司，瑞士）于实验第0、1、2、3、5、7 天检测小鼠背部创面血流情况。

1.3.3 白介素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子检测 于实验第0、1、2、3、5、7天收集创面渗出液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定白介素（IL）-1β、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等炎性细胞因子，按照试剂盒（上海恪敏生物科技有限公司）说明书操作。

1.3.4 生存分析 观察各组7 d累计生存率，并进行生存分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，重复测量的数据采用方差分析，两组间比较采用t检，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组烧伤创面的荧光强度

治疗前，两组的创面荧光强度相似，差异无统计学意义（P > 0.05）；治疗24 h后，对照组荧光信号强度显著升高（P < 0.05），实验组荧光强度降低（P < 0.05），两组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 两组背部创面血流量的变化情况

与治疗前比较，对照组经治疗第1、2天后背部创面血流量有所降低，第3、5、7天后陆续升高，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；实验组经治疗第1、2、3、5、7天后，小鼠背部创面血流量逐渐增加且明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3 两组外周血中炎性细胞因子水平

ELISA检测结果显示，实验组经VSD治疗后炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量较对照组明显减少，IL-8含量较对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P < 0.05），IL-10含量变化不明显（均P > 0.05）。见图1。

2.4 两组烧伤脓毒症小鼠生存率

自第2天开始，实验组生存率明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见图2。

3 讨论

VSD具有创面封闭和免疫调控作用，是近年来兴起的一种促进创面愈合的前沿技术。该技术在创面治疗中的作用已得到临床广泛认可。VSD可在创面局部形成持续负压，并在负压敷料和组织细胞之间产生机械应力作用于细胞，其中最重要的一种是细胞表面形成的剪切力，这种力的作用不仅有助于清除创面坏死组织，而且能促进肉芽组织生长及血管生成[7-9]。大量研究[10-11]表明，这种机械应力对内皮细胞形态、功能以及基因表达均有调节作用，更为重要的是可促使单核细胞、成纤维细胞等的增生和趋化。本研究采用VSD治疗C57BL/6J烧伤脓毒症小鼠，实验组的荧光信号强度较对照组显著降低（P < 0.05），提示VSD可以有效缩小烧伤感染创面面积，降低创面细菌含量。实验组经治疗第1、2、3、5、7天后小鼠背部创面血流量逐渐增加且明显高于对照组（P < 0.05或P < 0.01），提示实验组小鼠创面及创周血液供应良好，可能与VSD治疗能够清除创面代谢废物，提供营养、氧分，改善创面微环境，加速创面愈合有关。

适度的炎性反应可以调动机体免疫防护，清除细菌及坏死组织，保护宿主，但失控的、过度的炎性反应则可以导致组织损伤[12]。烧伤后由感染所致的全身性炎性反应与代偿性抗炎反应综合征相互作用的失衡即为烧伤脓毒症。烧伤脓毒症是烧伤后感染诱发的全身失控性炎症反应综合征，其发生机制极其复杂，涉及数量众多相互协同、相互诱生的免疫炎症细胞及细胞因子，但其中最为关键的是巨噬细胞[13-15]。在烧伤脓毒症的发生、发展中，巨噬细胞既是启动细胞，也是效应细胞，它的损伤与激活是机体发生失控性炎性反应、烧伤脓毒症发病的关键环节。巨噬细胞在内毒素的刺激下，往往分泌大量炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等，造成了体内促炎及抗炎因子的失衡，从而引发级联瀑布效应，最终导致炎性反应失控，诱发全身性损伤。因此，如何提高烧伤脓毒症疗效是亟待解决的难题。

TNF-α是炎性反应过程中出现最早、最重要的炎症介质，其广泛参与炎症的发生发展并发挥重要作用[16-17]。无论急、慢性创面，经治疗后早期TNF-α在创面组织中显著下调；而同样由活化的单核-巨噬细胞产生的与TNF-α有协同作用的IL-1β在急性创面中显著下调，在慢性创面中无明显变化[18-19]。经治疗人体血清中促炎性细胞因子IL-6的水平无明显变化[20]，IL-6与抗炎性细胞因子IL-10在体内往往存在负相关性，治疗4 h后，血清中IL-10水平显著升高[21]。IL-8是强力的趋化因子和促血管新生因子，在调节中性粒细胞和巨噬细胞的趋化中起着重要作用。研究表明[22]，经治疗患者局部创面组织中IL-8显著升高，但外周血中IL-8水平并无显著升高。本研究显示，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量较对照组明显减少，IL-8含量较对照组明显增加（均P < 0.05），IL-10含量变化不明显（均P > 0.05），与上述既往研究结果基本一致，提示VSD有可能通过调节局部炎性反应降低脓毒症的全身炎性反应水平。

综上所述，VSD治疗C57BL/6J烧伤脓毒症小鼠，可降低其创面细菌含量，改善血液供应，降低脓毒症的全身炎性反应水平，提高生存率。

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（收稿日期：2018-08-07 本文編辑：任 念）