杨小霞 巫培豪 谢俊刚 曹中 林曼玉 陈冰如 覃亮

(1. 肇庆市水产技术推广中心，广东肇庆 526061；2. 肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆 526061)

罗非鱼(Tilapia)又名非洲鲫鱼、福寿鱼、金凤鱼，原产于非洲东部等地，具有肉质鲜美、平价易得、营养价值高的优点，一直深受我国消费者喜爱。肇庆素有“中国罗非鱼之乡”的美誉，近十几年来罗非鱼及其相关产业链逐渐成为肇庆市主导的品种之一。但近年来频频爆发的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染，导致近三年来肇庆市以“吉富”系列罗非鱼为主感染无乳链球菌后发病面积超过4000hm2，累计经济损失超过5000万元，且情况不断加剧难以控制，成为该市罗非鱼产业亟须解决的重大隐患之一[1]。

紫背天葵(Begoniafimbristipula)，秋海棠科，秋海棠属。中国医学认为紫背天葵味甘，微酸，性凉，具清热解毒、润肺止咳、散瘀消肿、生津止渴之功效，治外感高热、中暑发烧、肺热咳嗽、伤风声嘶、痈肿疮毒、跌打肿痛等症。研究表明，紫背天葵可提高抗寄生虫和抗病毒的能力，对肿瘤有一定防效[2，3]。紫背天葵属于药食同源植物，既可入药，又是一种很好的营养保健品。本文对紫背天葵中的挥发油进行提取，并研究了其对罗非鱼无乳链球菌的抑制活性，以期对肇庆地区罗非鱼养殖业健康发展提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

新鲜紫背天葵采自市场，经烘干后供实验使用；无乳链球菌由肇庆市水产技术推广中心从患病罗非鱼脑部解剖分离纯化而来；脑心浸液(BHI)液体培养基。

ESJ120-4电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；DHG-9070B干燥箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；FY135粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；800型离心机，深圳市沙头角国华仪器厂；GCMS-QP2010气相色谱质谱连用仪，日本岛津公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；LRH-150生化培养箱，上海浦东荣丰科协仪器有限公司；YX280A手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器机有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫背天葵挥发油的提取

称取一定量已剪碎的药材，装入挥发油提取器中，加水浸泡过夜，水蒸气法蒸馏4h，得黄色透明具有浓烈香味的油状液体，收集挥发油。

1.2.2 紫背天葵挥发油GC-MS分析条件

GC条件：RTX-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，升温程序：从60℃开始，以7℃/min升温至200℃，最后以2℃/min升温至280℃；载气为He；载气流量：3.0mL/min；分流比30∶1，进样量1μL。

MS条件：质谱的电离方式为EI，灯丝电流0.5mA；电子能量70eV，倍增器电压1.0kV，离子源230℃，扫描周期0.3s，溶剂延迟2.50min。标准谱库为美国NIST谱库。

定性分析：取1.0μL挥发油，用气相色谱-质谱-计算机联用仪进行分析鉴定。通过NIST谱库自动检索获得初步鉴定结果。根据所得质谱图，结合相关文献进行人工谱图解析，以确认挥发油中各化学成分。

1.2.3 紫背天葵挥发油抑菌测定

取紫背天葵挥发油、头孢氨苄溶液、无菌水2mL于烧杯中，分别放入若干直径为6mm的无菌滤纸密封与浸泡过夜。

取出无乳链球菌菌悬液、BHI固体培养基，吸取10mL无乳链球菌菌液于离心管中以8000r/min转速离心1min，再用10mL无菌水重悬细菌，充分振荡摇匀，吸取200μL菌悬液于BHI固体培养基中涂布均匀，用镊子分别取出含药滤纸片吹干后贴于含菌的平板上，每个样品进行3组重复浓度。

以上操作均在无菌条件下进行，所应用的实验仪器均经高压灭菌处理，操作完成后将菌株置于37℃培养箱中恒温培养18～24h后观察结果，用游标卡尺量取抑菌圈大小，记录数据取平均值。

1.2.4 测定最低抑菌浓度(MIC)

紫背天葵挥发油用二倍稀释法用丙酮稀释成浓度为100%、80%、60%、40%、20%、10%的药液。取若干直径为6mm的无菌滤纸分别浸泡于不同稀释浓度的紫背天葵挥发油中，在无菌的条件下操作，分别吸取200μL菌液于BHI固体培养基中涂布均匀，每个平板贴上不同药液浓度的紫背天葵挥发油药片，每个平板贴上浸过丙酮的药片作阴性对比，每个浓度平衡3组。操作完成后将菌株置于37℃培养箱中恒温培养18～24h后观察结果，用游标卡尺量取抑菌圈大小，记录数据取平均值，以抑菌圈≥6mm的最低稀释浓度为最低抑菌浓度[4，5]。

2 实验结果

2.1 紫背天葵挥发油组分分析

用毛细管气相色谱法从紫背天葵挥发油中共分离出51个峰(见图1)，利用NIST’05系统谱库自动检索被分析组分的质谱，结合人工谱图检索鉴定各峰的化学组成，用峰面积归一化法测定出各化学成分的相对含量。根据所得质谱图，解析得到挥发油中的39种化学成分。

图1 紫背天葵挥发油总离子流图

已鉴定的成分占挥发油总量的97.16%，主要为萜烯类及其含氧衍生物，另外还含有酯、醇、醛、烷烃和酸酐等化合物。含量最高的是2-乙氧基丙烷，相对含量为50.51%；含量较高的是次亚麻油酸甲酯，相对含量为11.41%；其次是棕榈酸甲酯，相对含量为7.47%；正棕榈酸，相对含量为6.59%；三烯十八碳醇，相对含量为6.29%。本实验鉴定出来的成分大部分为酯类、酸类、醇类以及酮类化合物，酸类以不饱和酸居多。

2.2 紫背天葵挥发油抑菌活性研究

紫背天葵挥发油对无乳链球菌的抑菌效果见表1。实验结果表明，紫背天葵挥发油对无乳链球菌具有较好的抑制效果，对无乳链球菌的最低抑菌浓度为12.5%。

表1 紫背天葵挥发油对无乳链球菌的抑菌效果

3 结论

本文以紫背天葵为研究对象，对其挥发油成分进行了分析，并进一步研究了紫背天葵挥发油对罗非鱼无乳链球菌抑菌效果。实验结果表明，紫背天葵挥发油对无乳链球菌具有明显抑制效果，最低抑菌浓度为12.5%。由于该挥发油为混合物，所以对罗非鱼无乳链球菌起抑制的主要成分还需要进一步的分离研究。本实验采用的挥发油提取方法操作简单，将有助于解决肇庆市乃至全国各地罗非鱼感染无乳链球菌患病的几率，使得紫背天葵的市场应用价值得到进一步的提高。