王保国

(河北省廊坊市第四人民医院 普外科, 河北 廊坊, 065700)

在恶性肿瘤患者中，结肠、直肠癌是较为常见的消化道类疾病。趋化因子作为一种肿瘤分子标志物，其检测具有操作简便、价格较低以及创伤较小等优势[1]。相关研究[2]显示，趋化因子是细胞因子超家族的一种，具有控制细胞向炎症定向迁移的能力，趋化因子的功能由相应受体介导，二者的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统及组织间的定向迁移。趋化因子受体CCR4在某些肿瘤细胞中呈高表达，与多种肿瘤的生物学行为有关，其配体为CC趋化因子配体17(CCL17)，配体对受体的吸引可以促进CCR4表达阳性的肿瘤细胞循配体浓度梯度定向转移，可能形成了肿瘤转移机制[3]。本研究检测趋化因子受体CCR4在结肠、直肠癌中的表达情况，探讨趋化因子体CCR4在结肠、直肠癌中的相关作用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1—2018年2月廊坊市第四人民医院结肠、直肠癌原发灶外科手术标本41例用作免疫组织化学分析，设为实验组。选取同期良性结肠直肠肿瘤患者30例，设为对照组。趋化因子受体CCR4在结肠、直肠癌中的相关功能采用分组对比分析，分组依据为临床病理相关因素。纳入标准: ① 所有标本均经病理证实为肿瘤和非肿瘤组织; ② 所有入选患者未接受过放化疗; ③ 经患者本人及家属同意签字确认[4]。排除标准: ① 排除接受过放化疗的患者; ② 排除未经病理证实的患者标本[5]。

1.2 方法

仪器与试剂: Systems cxcr4抗体购自德国; 免疫组化试剂盒为KIT-9901; 柠檬酸组织抗原修复液、PBS、DAB均购自福州迈新; Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)、K1622、EP0404、R0191均购自法国[7]。CXCR4引物序列: 上游引物5′-ACAGCAGGCA CAGACAGGCA GU-3′(表达方式1); 下游引物5′-UAGCAGCGGG AACAGUUCUGTGG-3′(表达方式2)。手术过程中取结肠直肠肿瘤组织，并置入液氮中冷存。

1.3 测定方法

本研究采用免疫组化二步法行免疫组化染色。RT-PCR法所用的试剂[8]: 0.1% DEPC溶液、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水配制的75%乙醇、RNase-free的纯水，反转录试剂盒、dNTP mix, Taq酶，buffer、凝胶电泳缓冲液等。仪器、耗材[9]: 离心管、PCR管、PCR仪、冷冻离心机、水平电泳槽、电泳仪等。具体方法、步骤依据说明书执行。免疫组化二步法实验步骤: 预处理: 双蒸水(ddH2O)或PBS洗，利用二四苯梯度酒精、石蜡切片，脱蜡、水化，再行冰冻切片，再行烤片，温度控制在37 ℃, 以此作为抗原修复。3%过氧化氢(H2O2)，孵育10 min, 交内源性过氧化物酶去除。DAB显色，复染，脱水与透明，再行封片。

1.3 评价标准

比较免疫组化二步法与RT-PCR法检测趋化因子受体CCR4在结肠、直肠癌组织的阳性率。比较免疫组化二步法、RT-PCR法检测趋化因子受体CCR4与临床各病理因素的关系。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 两种检测方法检测趋化因子受体CCR4在结肠、直肠癌组织的阳性率比较

实验组中免疫组化法检测阳性患者比例显著高于对照组中免疫组化法检测阳性患者比例(P<0.05); 实验组中RT-PCR法检测阳性患者比例显著高于对照组中RT-PCR法检测阳性患者比例(P<0.05); 实验组PCR条带灰度比值显著高于对照组PCR条带灰度比值(P<0.05)。见表1。

表1 两种检测方法检测趋化因子受体CCR4在结肠、直肠癌组织的阳性率比较

2.2 两组检测方法检测趋化因子受体CCR4与临床各病理因素的关系

结肠癌肿瘤组织中CCR4阳性检测表达水平在性别、不同年龄、分化程度、淋巴结转移、肝转移、部位等临床病理因素无显著差异(P>0.05)。结肠癌肿瘤组织中CCR4阳性检测表达水平中, Duke分期存在显著差异(P<0.05)。见表2。

表2 两种检测方法检测趋化因子受体CCR4与临床各病理因素的关系

3 讨 论

CCL14-CCR4通道与肿瘤学生物学行为的研究[10-17]证实，趋化因子及其受体既能通过趋化、活化免疫细胞后抑制血管增殖而起到抗肿瘤的作用，又能通过刺激肿瘤生长、趋化瘤细胞以及促进血管增殖和促进细胞外基质降解而达到促肿瘤生长浸润、侵犯、转移的效应。由此可见，趋化因子受体及配体系统与肿瘤的关系具有双向性，且趋化因子受体及其配体网络调控受诸多因素的影响，肿瘤的形成和发展中趋化因子网络的参与是复杂而精细的。合理的应用恰当的趋化因子或其受体可有效地诱导、活化、趋化免疫效应细胞，导向杀伤肿瘤细胞。趋化因子中和抗体、受体拮抗剂、抑制剂也可阻断异常的信号传导通路[18-20]。

本研究结果显示，实验组免疫组化法检测阳性率39.02%, 显著高于对照组免疫组化法阳性检测率13.33%(P<0.05); 实验组RT-PCR法阳性检测率43.90%, 显著高于对照组RT-PCR法阳性检测率10.00%(P<0.05); 实验组PCR条带灰度比值(0.548 1±0.062 4), 显著高于对照组PCR条带灰度比值(0.341 7±0.069 6) (P<0.05)。结肠癌肿瘤组织中CCR4阳性检测表达水平在性别、不同年龄、分化程度、淋巴结转移、肝转移、部位等临床病理因素无显著差异(P>0.05)。结肠癌肿瘤组织中CCR4阳性检测表达水平中Duke分期存在显著差异(P<0.05)。总之，病理检测可提示患者Duke分期情况，结肠癌肿瘤组织中CCR4在患者机体免疫调节中具有重要作用。