刘学飞，张俊梅，徐龙

解放军第202医院1肿瘤介入科，2皮肤科，沈阳110812

3沈阳军区总医院肿瘤科，沈阳110812

乳腺癌是一种在女性人群中常见的恶性肿瘤， 严重威胁女性健康。在西方发达国家，乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤首位，其致死率仅次于肺癌[1-2]。近年来随着经济的发展、人们生活节奏和生活习惯的改变，乳腺癌在中国女性人群中的发病率逐年升高[3]。目前临床上对于乳腺癌的治疗主要以手术和化疗相结合为主，但乳腺癌细胞具有强大的转移和扩散能力，预后效果并不理想[4-5]。因此，从分子水平研究乳腺癌细胞的迁移和侵袭机制，从而寻找有效的治疗方法具有重要意义。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）是磷脂酰乙醇胺家族成员之一，在肿瘤细胞内多组激酶信号通路中发挥重要作用[6-7]。核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是一类转录因子，在多种细胞中均有表达，能参与多种基因的表达调控[8]。研究表明，RKIP能够抑制肿瘤细胞中NF-κB信号转导通路的活性，从而调控肿瘤细胞的生长、转移和凋亡，但两者在乳腺癌细胞中的关系尚未清楚[9]。本研究分析了良性和恶性乳腺肿瘤组织中RKIP的表达水平，探讨了人乳腺癌细胞中RKIP对乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响及与NF-κB可能存在的关系，旨在为乳腺癌的临床治疗及预后评估提供新的靶点，现报道如下。

1 材料

1.1 标本收集

收集2015年4月至2016年12月于解放军第202医院就诊的63例乳腺肿瘤患者的肿瘤组织标本。所有患者均为女性，在手术前均未接受过任何放疗、化疗、内分泌治疗。63例乳腺肿瘤组织中，良性乳腺肿瘤组织28例，患者年龄为18～58岁，平均（33.28±3.57）岁；恶性乳腺肿瘤组织35例，患者年龄为21～60岁，平均（36.43±3.82）岁。

1.2 细胞及载体

高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-435和GV141载体均购自上海博谷生物科技有限公司。

1.3 实验试剂

DMEM培养基和胎牛血清（fatal bovine serm，FBS）均购自美国Sigma公司，兔抗人RKIP抗体购自北京美天晴生物技术有限公司，Lipofectamine 2000购自美国Life Technology公司，SP免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Trizol和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒均购自美国Sigma公司，NF-κB引物购自上海生工生物工程有限公司，Transwell小室和Matrigel液均购自美国Corning Life Sciences公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自上海艾博抗贸易有限公司。

1.4 实验仪器

恒温培养箱、高速离心机均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，高压灭菌锅购自上海巴玖实业有限公司，BioTek Synergy HT酶标仪、DYC-p32型电泳槽均购自美国Bio-Rad公司，Leica DC300F显微照像系统购自日本奥林巴斯公司。

2 方法

2.1 免疫组织化学法检测良性和恶性乳腺肿瘤组织中RKIP的表达水平

所有肿瘤组织标本均由本院病理科医师经10%福尔马林固定，石蜡包埋后保存。分别从良性和恶性乳腺肿瘤组织中随机选取10个标本，每个标本取3张切片，按照说明书中的操作步骤，应用免疫组织化学法检测肿瘤组织中RKIP蛋白的表达水平，每张切片随机选取3个视野，在光学显微镜下观察其染色情况，用光学显微镜测定观察区域阳性细胞的积分光密度值（integrated optical density，IOD）。

2.2 MDA-MB-435细胞转染

2.2.1 细胞培养 将乳腺癌MDA-MB-435细胞复苏后，转移至DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养并进行传代，取2～3次传代后的细胞用于实验。将处于对数生长期的细胞转移至6孔板中，密度为8×105/孔，保证在转染时细胞密度为80%～90%。

2.2.2 细胞转染及转染复合物的制备 将含有RKIP基因的cDNA插入GV141载体中构建RKIP质粒，作为RKIP过表达组的转染质粒；以空白GV141载体构建空白质粒，作为对照组的转染质粒。将 2 μg 上述配制好的质粒和 5 μl的 Lipofectamine 2000分别加入250 μl DMEM选择培养基中，充分混匀后用移液枪轻轻吹打，室温下孵育20 min形成转染复合物。

将传代的MDA-MB-435细胞转移至不含抗生素的DMEM培养基中，密度为8×105/孔，将上述配制好的转染复合物加入到6孔板中，与MDA-MB-435细胞共培养12 h，然后更换完全培养基，继续培养48 h，构建RKIP过表达的细胞系和RKIP正常表达的细胞系。

2.3 Transwell小室检测细胞的迁移能力

2.3.1 MDA-MB-435单细胞悬液制备 将转染后的两组细胞离心，弃上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，加入含1%FBS的DMEM培养基，重悬细胞，用移液枪将细胞悬液转移至6孔板内，调整细胞浓度为2×105/孔。

2.3.2 接种及培养细胞 将200 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室中，同时向其中加入含1%FBS的DMEM培养基，下室中加入等量的不含FBS的DMEM培养基，在细胞培养箱中培养24 h。

2.3.3 细胞计数Transwell小室培养24 h后取出，擦去上室内细胞，用0.1%结晶紫染色，转用33%醋酸溶液洗脱，在Leica DC300F显微镜下随机选取3个视野观察并拍照，计算细胞数目。实验重复3次。

2.4 Transwell小室检测细胞的侵袭能力

将50 mg/L的Matrigel液按1∶8稀释后，包被在Transwell小室底部膜的上室面，37℃环境下风干，使Matrigel聚合为凝胶，形成人工基底膜。后续步骤同2.3.1、2.3.2和2.3.3。

2.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测RKIP蛋白的表达情况

将细胞用RIPA细胞裂解液裂解后提取蛋白质，用10%分离胶溶液、5%浓缩胶溶液灌注后进行电泳，电泳结束后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC膜），将NC膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中封闭2 h，先后加入稀释后的一抗、二抗，TBST洗涤NC膜；增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色；胶片扫描后应用Bandscan 5.0软件进行灰度分析。RKIP蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示RKIP蛋白的表达水平。

2.6 RT-PCR检测NF-κB基因的表达情况

应用Trizol试剂盒提取总RNA后进行逆转录。取2µl RNA进行RT-PCR扩增，以GAPDH基因为内参。GAPDH正向引物为5'-GCATAATAATGAGCCAAGGACT-3'，反 向引物为 5'-AGAACGTCTCTCACTT-3'；NF-κBmRNA的正向引物为5'-GTCTTCCTGCTACACTCTTA-3'，反向引物为5'-ACACACTCCTGTGAACGCC-3'。NF-κBmRNA及GAPDH的扩增条件：94℃ 2 min（预变性）；94 ℃ 30 s（变性），55 ℃ 30 s（退火），72 ℃ 2 min（延伸），共35个循环；72℃总延伸6 min。取5µl RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析目的基因NF-κBmRNA和内参基因GAPDH条带的灰度值，计算NF-κBmRNA的相对表达量。

2.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 RKIP表达水平的比较

良性乳腺肿瘤组织中RKIP的表达水平较高，IOD值为（0.527±0.057），高于恶性乳腺肿瘤组织的（0.217±0.048），差异有统计学意义（t=14.64，P=0.03）。

3.2 RKIP过表达对细胞迁移和侵袭的影响

RKIP过表达组迁移细胞数目和侵袭细胞数目均明显少于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 RKIP过表达组和对照组MDA-MB-435细胞迁移与侵袭数目的比较（±s）

表1 RKIP过表达组和对照组MDA-MB-435细胞迁移与侵袭数目的比较（±s）

组别R KIP过表达组对照组t值P值4 9.6 7±3.3 3 1 2 3.0 0±7.0 0 1 7.3 7 0.0 0 1 3 0.6 7±2.3 3 1 0 4.3 3±1 0.6 7 1 2.6 8 0.0 0 5迁移细胞数目侵袭细胞数目

3.3 Western blot检测RKIP蛋白表达水平

Western blot检测结果显示，RKIP过表达组的RKIP表达水平为（0.059±0.005），明显高于对照组的（0.009±0.002），差异有统计学意义（t=13.89，P＜0.01）。

3.4 RT-PCR检测NF-κB mRNA表达水平

RT-PCR检测结果显示，RKIP过表达组中NF-κBmRNA的相对表达量为（0.120±0.016），明显低于对照组的（0.380±0.025），差异有统计学意义（t=7.767，P=0.001）。

4 讨论

乳腺癌是世界范围内威胁女性身心健康的一种致死性恶性肿瘤，在中国女性人群中的发病率呈增长趋势[1-2]。目前对于乳腺癌的治疗主要以手术和化疗为主，但这些手段只能控制原发肿瘤，一旦肿瘤出现转移，会极大地影响预后，致使患者的病死率大大增加[4-5,10]。因此，研究乳腺癌细胞迁移、侵袭的分子机制，从而找到抑制乳腺癌转移、扩散和恶化的治疗途径，提高早期诊断率，降低病死率，是目前临床上迫切需要解决的问题。

肿瘤转移被视为肿瘤发展至晚期的标志[11]。研究表明，RKIP与结肠癌、乳腺癌的转移密切相关[12-13]。姚志强等[14]研究结果显示，乳腺癌组织中RKIP的阳性表达率为51.9%，低于癌旁乳腺组织和乳腺增生症组织的81.8%、100%，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示RKIP在乳腺肿瘤组织中表达下调，而这种现象可能与乳腺癌的发展有关。本研究检测了良性与恶性乳腺肿瘤组织中RKIP的表达水平，结果显示，良性乳腺肿瘤组织中RKIP的表达水平高于恶性乳腺肿瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05），与上述研究结果一致。本研究结果还显示，RKIP过表达组迁移细胞数目为（49.67±3.33），明显少于对照组的（123.00±7.00），差异有统计学意义（P＜0.01）；RKIP过表达组侵袭细胞数目为（30.67±2.33），明显少于对照组的（104.33±10.67），差异有统计学意义（P＜0.01）。提示RKIP高表达可使乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力受到显著抑制，表明RKIP基因可能与乳腺癌细胞的迁移和侵袭有关。

NF-κB是一类重要的转录因子，其在肿瘤细胞的发生、发展、迁移、侵袭等过程中发挥重要的调控作用，在卵巢上皮性肿瘤和乳腺癌组织中均发现了NF-κB的高表达[9,14]。研究证实，NF-κB对肿瘤细胞的调控作用受上游RKIP的直接影响，RKIP能够抑制NF-κB的表达及其作用的发挥[9]。本研究结果显示，RKIP过表达组中RKIP的表达水平为（0.059±0.005），明显高于对照组的（0.009±0.002），差异有统计学意义（P＜0.01）。RKIP过表达组中NF-κBmRNA的相对表达量为（0.120±0.016），明显低于对照组的（0.380±0.025），差异有统计学意义（P＜0.01）。提示 RKIP过表达能够抑制NF-κBmRNA的表达，RKIP对乳腺癌细胞迁移和侵袭的调控可能与其对NF-κB的抑制作用有关。

综上所述，RKIP与乳腺癌的恶化程度有关，RKIP能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，这种抑制作用可能是通过对NF-κB的负调控而实现。