王蕾　谢月群　陈玲珑　陈新国　张和

[摘要] 目的 分析脓毒血症患者IL-10的启动子区域转录起始位点上游第1082位点的多态性，探讨其与脓毒血症易感性之间的关系。 方法 采用聚合酶链反应-限制性片段多态性（PCR-RELP）检测IL-10基因-1082位点多态性，SPSS17.0分析各位点的基因型分布和等位基因频率。 结果 IL-10-1082位点的多态性在脓毒血症组（AA：58.16%、GA：39.80%、GG：2.04%）与对照组（AA：73.75%、GA：26.25%）的基因频率有显著性差异（P<0.05）。脓毒血症组中GA基因型的频率显著高于对照组（P=0.038），脓毒血症组中G等位基因的频率显著高于对照组（P=0.015）。结论 IL-10-1082 GA基因型携带者比AA基因型患者的脓毒血症风险性高，IL-10-1082的G等位基因比A等位基因患脓毒血症的风险性高。

[关键词] 脓毒血症；疾病遗传易感性；白细胞介素10；多态性

[中图分类号] R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）24-0001-03

Study on the relationship between locus 1082 gene polymorphism in IL-10 promoter region and susceptibility to sepsis

WANG Lei1 XIE Yuequn1 CHEN Linglong1 CHEN Xinguo1 ZHANG He2

1.Department of Emergency， Wenzhou Peoples Hospital in Zhejiang， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Radiotherapy， Wenzhou Central Hospital in Zhejiang， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the polymorphism at locus 1082 in the upstream of the transcriptional start site in the promoter region of IL-10 in sepsis patients， and to explore its relationship with susceptibility to sepsis. Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphism（PCR-RELP） was used to detect the IL-10-1082 polymorphism. SPSS 17.0 was used to analyze the genotypic distribution and allele frequencies at each locus. Results The gene frequency of polymorphism of IL-10-1082 in the sepsis group（AA： 58.16%， GA： 39.80%， GG： 2.04%） and the control group（AA： 73.75%， GA： 26.25%） had significant differences（P<0.05）. The frequency of GA genotypes in the sepsis group was significantly higher than that in the control group（P=0.038）. The frequency of G allele in the sepsis group was significantly higher than that in the control group（P=0.015）. Conclusion IL-10 -1082 GA genotype carriers have a higher risk of sepsis than those with AA genotypes. The G-10 allele of IL-10-1082 has a higher risk of sepsis than the A allele.

[Key words] Sepsis； Disease genetic predisposition； IL-10； Polymorphism

膿毒血症是当今危重症医学的研究焦点和棘手问题。在全世界，脓毒血症每年的病死率高达36800例，其死亡率与心肌梗死相近，已成为老年人十大死因之一[1]。近年来众多研究者正在研究脓毒血症的易感因素。脓毒血症是一种常见危重症患者较为严重的感染性、多器官损伤疾病，多种炎症介质参与其发生与发展过程，期间分泌大量炎症细胞因子[2]。IL-10基因定位于1号染色体q31-32区域[3]，-1082 G/A（rs18 00896）为其基因多态性之一。有研究显示白细胞介素10（Interleukin-10，IL-10）启动子区的基因多态性能够影响IL-10的启动子活性，进而调节IL-10的表达[4-6]。IL-10是重要的抗炎症的细胞因子，IL-10通过Th1细胞机制调节免疫应答，拮抗促炎症细胞因子如TNF-α，从而促进脓毒血症的发生[7]。此外，IL-10在类风湿关节炎、病毒性心肌炎的发生与发展中也扮演着重要的角色，其通过抑制炎症反应，从而促进疾病的发生与发展[8]。研究显示，与IL-18及肿瘤坏死因子-α相比，IL-10对老年脓毒血症患者的预后预测价值更佳[8]。然而IL-10-1082的基因多态性对脓毒血症发生的易感性至今还不明确，本文采用 PCR 限制性酶切多态性（PCR-RFLP）的方法研究 IL-10 的基因启动子区-1082位点的多态性与脓毒血症发生的关系，旨在探讨其对脓毒血症易感性的影响，为脓毒血症的预防研究提供科学基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究收集2016年1月～2017 年9月于我院住院并确诊的脓毒血症患者98例，诊断依据“2001年危重病医学会/欧洲危重病医学会/美国胸科医师协会/外科感染学会关于全身性感染的定义会议”诊断标准[9]。健康对照组选自2017年1～9月在温州市人民医院体检健康的80名志愿者，最大年龄90岁，最小年龄37岁，中位年龄61 岁。脓毒血症组最大年龄86岁，最小年龄27岁，中位年龄65岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制备 取所有受试者静脉血3 mL，EDTA抗凝，用改良碘化钠法提取白细胞DNA，保存在-20°C条件下。

1.2.2 IL-10多态性分析 采用链合酶联反应-限制性片断长度多态性（polymerase chainreaction with restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术，检测IL-10基因启动子区-1082位点的基因型。根据参考文献并应用Primer Premier 5.0来设计引物。IL-10-1082位点的引物序列，正向链： 5‘-GACAACACTACTAAGGCTCCTTTGGGA-3 反向链： 5‘-GTGAGCAAACTGAGGCACAGA AAT-3[10]。扩增条件为55℃ 45 s，72℃ 60 s，94℃ 30 s，共35个循环。PCR 的反应体系为50 μL，包括以下组分：DNA聚合酶1.25 U，上下游引物各1.0 μL，10×buffer 5.0 μL，MgCl2 3.0 μL，dNTPs 3.0 μL，灭菌双蒸水补至50 μL，模板50 ng，则进行下一步酶切实验。取PCR产物10 μL，加Bsl Ⅰ 10 U，10×NEBuffer3 3.0 μL，灭菌双蒸水补至30 μL，水浴55℃ 2 h，酶切后于3%的琼脂糖凝胶上电泳，鉴定结果。

1.2.3 IL-10 -1082位点PCR扩增及酶切分析 IL-10-1082位点的PCR产物经BslⅠ酶切电泳后产生278 bp及37 bp 2 个片段为 AA型，产生278 bp、253 bp、37 bp、25 bp 4个片段为GA型，253 bp、37 bp、25 bp 3个片段为GG型。

1.3 统计学方法

采用 SPSS17.0软件进行统计处理，各组IL-10-1082位点基因型及等位基因频率比较，其分布符合Hardy-Weinberg平衡规律，说明本实验人群具有群体代表性，该人群的IL-10基因分布可反映整体人群基因的分布情况。计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，并计算比数比（OR），进行相关性分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本基本情况

脓毒血症组与对照组在性别、年龄及吸烟情况比较无显著性差异（P>0.05）。见表1。

2.2 IL-10-1082各基因型分布与脓毒血症相对风险分析

IL-10-1082的基因分型和等位基因频率与脓毒血症易感性的关系中，脓毒血症组IL-10-1082位点GA基因型分布频率显著高于对照组（OR=2.018，95%CI：1.053～3.868，P=0.038），对照组中未检测到 IL-10-1082GG基因型，等位基因分析结果显示脓毒血症组G等位基因分布频率显著高于对照组（OR=2.014，95%CI：1.168～3.473，P=0.015）。见表2。

3 讨论

IL-10是公认的炎症抑制因子，主要是由Th2细胞、巨噬细胞、单核细胞及基质细胞等分泌，它的主要功能是抑制Th1细胞，是调节促炎细胞因子的重要的抗炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子TNF-α及一氧化氮的合成，炎症细胞的凋亡和巨噬细胞活化的抑制等[11-12]。在人类中，血循环中IL-10水平升高与脓毒血症性休克、损伤的严重性以及死亡率相关。人类IL-10基因包含5个外显子和4个内含子，位于1号染色体q31-32区域，IL-10的表达可受转录水平[13-14]和转录后水平[15-16]的调节，研究表明，IL-10主要是受转录水平调控，且IL-10分泌很大程度上受到遗传因素的影响[17]，其转录起始位点上游5 kb的区域内，至少有23个单核苷酸多态性（SNP）位点，其中研究最多的是启动子上游第1082位点（G/A）SNP[18]。IL-10基因启动子区特定的SNP可正向或负向影响IL-10的分泌水平[18-19]，从而影响对某种特定疾病的易感性。研究表明IL-10基因多态性可能影响肿瘤的易感性与IL-10-1082基因位点等位基因G有关，如子宫颈癌、肺癌等，其影响机制可能与下调IL-1B、TNF-α和血管内皮生长因子的活性有关[20]。在IL-10基因中，-1082位置处的G单核苷酸启动子多态性在IL-10的调节中是重要的。对于G等位基因纯合的个体（-1082 GG）在体外刺激后具有更高的循环IL-10，更高的IL-10 mRNA表达和更高的IL-10产生[21]。

本文研究结果显示两组患者IL-10-1082位点基因型分布频率差异均具有统计学意义（P=0.038），脓毒血症组IL-10-1082 GA 基因型频率高于对照组，相对风险为2.018（1.053～3.868）；等位基因分析結果显示脓毒血症组G等位基因分布频率高于对照组，有显著性差异（P=0.015），相对风险为2.014（1.168～3.473），提示-1082 位点G等位基因与脓毒血症的发生有相关性。体内外的研究表明 IL-10-1082 A等位基因的 IL-10 表达较低[18，22，23]，而 IL-10-1082 G等位基因的IL-10表达较高[18]，这表明-1082位点多态性影响IL-10的表达水平，IL-10作为一种抑制炎症因子，是其促进脓毒血症的发生，是-1082位点与脓毒血症易感性相关的遗传学依据，本研究结果也与之相一致。但有关IL-10-1082基因多态性与脓毒血症发生的相关报告较少，其关系尚不明确，仍有待进一步的深入研究来阐明。

本研究分析IL-10 基因啟动子-1082位点基因多态性，结果显示：IL-10-1082 GA基因型携带者比AA基因型患者的脓毒血症风险性高，IL-10-1082的G等位基因比A等位基因患脓毒血症的风险性高。此研究结果与之前体内外研究数据相一致，为脓毒血症的病因学和遗传学研究提供了有力的实验数据，提示IL-10可作为防治脓毒血症的一个重要靶点。

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（收稿日期：2017-11-24）