陈博 孙晓岩 袁细妹

MTHFR作为叶酸代谢过程中的关键酶,可将叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化成具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸,从而进入甲基传递通路,为Hcy提供甲基,使血浆Hcy保持在较低水平。血浆Hcy水平上升与孕期疾病和出生缺陷有关,同时也是诱发心血管疾病的主要危险因素之一［1-4］。本研究通过对MTHFR不同基因型增补叶酸效果进行研究,为制定个性化叶酸增补方案提供参考,旨在减少出生缺陷,预防孕期及心脑血管疾病。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2016年1～8月本院招募的120例健康女性志愿者作为研究对象,年龄22～45岁,平均年龄(33.52±4.34)岁。纳入标准：无家族性遗传病史；无免疫系统、血液系统、慢性疾病者；入组前1周未曾服用叶酸或B族维生素。排除标准：妊娠期、哺乳期女性；既往有胃肠切除手术史者；肝、肾功能不全者。所有入选者均签署知情同意书。

1. 2 方法

1. 2. 1 基因检测 对所有受检者进行空腹抽取外周静脉血5 ml,DNA提取通过柱式抽提试剂盒进行抽提,提取结束后并进行DNA浓度测定。蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)A66G、MTHFR A1298C、C677T 的基因多态性采用 MASS ARRAY技术进行单核苷酸多态性(SNP)分型检测,利用MASS ARRAY的引物设计平台设计聚合酶链式反应(PCR)引物,包括一对多重PCR扩增引物,及一条MASS EXTEND延时引物。然后进行 PCR,每个反应体系总体积为 5 μl,1 μl包含浓度为 20 ng/μl的 DNA 模板 ,1.8 μl无酶水 ,0.5 μl 10×PCR buffer,0.4 μl 25 μM MgCl2,0.1 μl 25 μM dNTP Mix,1 μl 0.5 μM Primer Mix,0.2 μl 5 U/μl PCR Enzyme。设定反应条件为 ：95℃ 2 min,然后再完成 20 个循环的扩增 (95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min)与 45 个循环的扩增。结束整个反应过程之后得到的PCR产物经过树脂纯化后在 Nanodispenser Spectro CHIP 芯片上点样 ,然后进行MASS ARRAY 分析 ,每个检测点只需 3～5 s,全自动分析 ,通过TYPPER4.0软件分析实验结果。

1. 2. 2 研究分组 根据MTHFR 677C/T基因型检测结果分为CC型37例、CT型42例、TT型41例。根据是否增补叶酸再将三种基因型随机分为观察组和对照组,CC型的观察组19例,对照组18例；CT型的观察组和对照组各21例；TT型的观察组21例,对照组20例。CC型、CT型、TT型基因的观察组口服叶酸片 400～800 μg/次 ,1 次 /d,连续服用 8 周；对照组不给予任何干预。试验期间,所有研究对象禁服含有叶酸或B族维生素成分的营养补充剂。

1. 3 血液指标检测 以下指标在干预前和干预后2个月各检测1次。上午空腹抽取肘正中静脉血。检测血浆叶酸水平和Hcy水平；使用罗氏电化学发光仪E602,按照试剂盒说明书操作步骤完成血清叶酸检测,日立7600全自动生化仪进行检测,按照试剂盒说明书操作步骤完成Hcy检测,其中Hcy在5～15 μmol/L浓度范围内视为正常。

1. 4 观察指标 采集受试者肘正中静脉血,比较CC型、CT型、TT型及三种基因的观察组和对照组的血浆叶酸水平、血浆Hcy水平。

1. 5 统计学方法 采用Empower Stats与R软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,满足正态分布时,采用t检验或方差检验；不同时满足正态分布和方差齐时,采用秩和检验,P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 不同基因型血浆叶酸、血浆Hcy水平比较 TT型的血浆叶酸水平明显低于CT型、CC型,差异有统计学意义(P＜0.05)。TT型的血浆Hcy明显高于CT型、CC型,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2. 2 不同基因型观察组与对照组血浆叶酸、血浆Hcy水平比较 干预后,CC型、CT型、TT型基因的观察组血浆叶酸水平均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)；TT型基因的观察组血浆Hcy水平低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2。

表1 不同基因型血浆叶酸、血浆Hcy水平比较( )

表1 不同基因型血浆叶酸、血浆Hcy水平比较( )

注 ：与 TT 型比较 ,aP＜0.05

基因型 例数 血浆叶酸(μg/L) 血浆Hcy(μmol/L)TT 型 41 5.76±1.56 14.15±2.07 CT型 42 6.57±1.68a 11.36±1.81a CC型 37 9.41±1.77a 10.64±1.36a

表2 不同基因型的观察组与对照组血浆叶酸、血浆Hcy水平比较( )

表2 不同基因型的观察组与对照组血浆叶酸、血浆Hcy水平比较( )

注 ：与对照组比较 ,aP＜0.05

基因型 组别 例数 干预前 干预后血浆叶酸(μg/L) 血浆Hcy(μmol/L) 血浆叶酸(μg/L) 血浆Hcy(μmol/L)TT型 观察组 21 5.43±1.96 14.31±1.46 11.46±1.76a 8.33±1.25a对照组 20 5.83±1.46 13.82±1.33 6.93±1.56 12.12±1.33 CT型 观察组 21 6.85±1.76 11.69±1.14 11.58±1.54a 7.39±1.43对照组 21 6.45±1.51 9.86±1.37 7.55±1.44 7.16±1.45 CC型 观察组 19 9.37±1.80 10.29±1.08 21.57±1.32a 8.19±1.28对照组 18 8.67±1.57 9.45±1.25 9.27±1.75 8.45±1.25

3 讨论

MTHFR是人体叶酸代谢中的非常重要的酶,该酶能够通过Hcy的重新甲基化过程为蛋白质及DNA的甲基化提供甲基,从而降低Hcy水平。Hcy水平上升与孕期疾病、出生缺陷、动脉粥样硬化及心肌梗死等心血管疾病密切相关［5,6］。叶酸是一种水溶性维生素,其主要作用是降低神经管畸形和唇裂胎儿出生率。叶酸被人体吸收后会以N5-甲基四氢叶酸形式存在于血液中,并与白蛋白疏松结合后经叶酸受体摄入细胞中,并在维生素B12依赖的蛋氨酸合成酶的作用下形成四氢叶酸,从而发挥自身作用［7］。MTHFR在叶酸的代谢过程中具有重要作用 ,研究指出［8］,MTHFR 677C/T 的基因多态性对该酶的活性有一定影响,从而造成叶酸代谢障碍,增加孕期疾病、出生缺陷、心血管疾病的发生风险。由于不同MTHFR基因分型对机体叶酸代谢的影响不同,因此通过检测MTHFR基因的多态性,为临床增补叶酸提供科学依据［9,10］。

本研究结果显示,TT型的血浆叶酸水平明显低于CT型、CC型,差异有统计学意义(P＜0.05)。TT型的血浆Hcy明显高于CT型、CC型,差异有统计学意义(P＜0.05)。表明MTHFR基因分型与血浆叶酸、Hcy水平有关,且TT型基因发生叶酸代谢障碍、血浆Hcy水平上升的风险最高。原因可能是MTHFR基因突变可降低MTHFR酶活性,且对TT型基因的MTHFR酶活性降低最明显［7］。

经叶酸干预后,CC型、CT型、TT型的观察组血浆叶酸水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。表明叶酸干预后,可提高三种基因型受试者的血浆叶酸水平,对于预防孕期疾病、出生缺陷、心血管疾病有一定作用。经叶酸干预后,TT型的观察组Hcy水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。而在其他两种基因型中,Hcy水平下降并不明显。表明在TT型基因较CC型、CT型基因有更明显的Hcy下降反应。虽然TT型基因的观察组Hcy水平降低幅度最大,但其Hcy水平均较CC型、CT型基因的观察组Hcy水平高。考虑原因可能是TT基因型的Hcy水平较高有关,除此之外还可能与样本量有关,今后可进行多中心、大样本的研究予以证实。

综上所述,对MTHFR三种基因型人群增补叶酸均可提高血浆叶酸水平,降低TT型Hcy水平。TT型基因对叶酸治疗较敏感,尤其在降低Hcy水平上有一定优势。