翟阳阳 宋金俤* 吴成龙 曹艳芳 蒋 宁

（1.江苏蕈源种业科技有限公司，江苏 南京 211302；2.江苏省农业科学院，江苏 南京 210014）

阿魏蘑（Pleurotus nebrodensis），又名白灵菇、白阿魏蘑，多叫白灵菇，隶属于担子菌亚门（Basidiomycotina），伞菌纲（Agaricomycetes），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleurotus）。野生阿魏蘑仅生长在我国新疆天山、塔城的阿魏滩上。其生长方式为寄生或腐生。寄主主要为伞形花科植物阿魏、刺芹的腐烂根茎。因其口味上佳，营养丰富，被誉为“草原上的牛肝菌” “素鲍鱼” “蚝菇王”等。

据国家食品监督检验中心检测，阿魏蘑子实体干品中蛋白质、脂肪、灰分、粗纤维、碳水化合物、多糖含量分别为 17.7%、4.31%、4.8%、15.4%、43.2%、19%[1]。所含人体必需氨基酸占氨基酸总量的35%，高于一般食用菌的25%。其中，赖氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的含量明显高于其他侧耳属品种[2]。有报道指出，阿魏蘑子实体中的多糖具有提高人体非特异性免疫功能和特异性细胞免疫功能的作用[3]。因此，它是一种高蛋白、低脂肪，富含矿质元素和维生素D[4]等的优质珍稀食用菌。

阿魏蘑原基为球状或短棒状，子实体多单生。子实体农艺性状因母种菌株的不同而表现出较大的差异，现工厂化主栽品种以掌状、扇形为主，野生阿魏蘑有马蹄状、柱状及不规则形。子实体表面白色或暗黄色，有些菌株子实体表面有微纹，单朵产量重者可达500 g以上。基部下凹或平展，具有一定的向光性，菌盖直径 80～200 mm，菌柄长短粗细不一，肉质中实脆嫩，具特殊香味。

阿魏蘑工厂化生产过程大体可概括为菌种制备→制包接种→发菌→后熟→冷（温差）刺激→搔菌→催蕾→疏蕾→采收→包装储存、运输→销售。阿魏蘑对生长环境要求严格，生产周期长，成本较高。自1983年在新疆地区成功实现人工栽培以来，虽然国内工厂化生产企业逐步增加，但仍无法满足市场需求。国内其他地区由于栽培时间较短，经验不足，对其生物学特性研究不够透彻，加之菌种退化快等原因，导致工厂化生产中易出现畸形菇多、产量低或菌包不出菇等现象，严重影响生产企业的积极性，制约了阿魏蘑产业的发展。

食用菌的育种方法主要有野生菌株驯化育种、孢子分离育种、诱变育种及原生质体融合育种。目前，孢子分离育种与分子标记结合起来成为一种新的食用菌育种方法[5]。本研究主要是通过 ISSR及RAPD分子标记技术，分析鉴别各供试菌株之间的亲缘关系及遗传相关性，结合各菌株的农艺性状确定杂交亲本。通过单孢杂交育种并对得到的杂交菌株进行 ISSR分子标记，鉴定其是否属于新品种，作出优质高产抗病阿魏蘑新品种选育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试亲本菌株共计 26种，来源及菌丝体性状详见表1。

1.2 试验方法

（1）培养基。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，自来水1 L，pH自然。原种和栽培种培养基：棉籽壳45%，玉米芯24%，麸皮20%，木屑10%，石灰1%，水分62%～64%，pH 7.5。

表1 供试菌株基本性状

（2）供试菌株RAPD与ISSR分子标记鉴定。本研究ISSR与RAPD分子标记鉴定供试菌株委托南京钟鼎生物技术有限公司进行。由于供试菌株香阿魏与1505-2野阿魏是野生采集分离的菌株，所以利用 ISSR分子标记来鉴定它们是否属于阿魏蘑的一类。其余24个供试菌株则采用RAPD分子标记技术分析鉴定它们之间的遗传差异。具体操作参照①食用菌菌种真实性鉴定 RAPD法，标准编号：NY/T 1743-2009；②食用菌菌种真实性鉴定 ISSR法，标准编号：NY/T 1730-2009。

（3）供试菌株品比试验。根据栽培料配方称取原料，加水拌匀，使栽培料水分达到62%～64%。将每个供试菌株经母种阶段扩繁培养后，接种于18×33（cm）栽培料包进行暗室恒温培养，培养温度24±2 ℃，时间45天左右，每个菌株接种50包，设置3个重复。待菌丝长满菌包后进行一段时间的后熟培养，后熟期一般为 60天。成熟的标志是菌包变软，富有弹性，而部分品种菌包会出现较厚的菌被。然后将菌包移入冷房进行出菇管理[6]。

①冷刺激：菌包移入冷房后，设定温度-3～3 ℃，关闭灯光，维持7天。②搔菌催蕾：完成低温刺激后，打开袋口，用镊子去除接种块，进行催蕾。催蕾时同样需要温差刺激，高温维持在 15～18 ℃，低温维持在5～8 ℃，每天重复5次。湿度设定为85%～95%。在保证温湿度的前提下，尽可能通入经过滤的新风使 CO2浓度维持在 1 000 mg/kg以下。出菇房光照强度在300 lx以上，10～15天在搔菌处即出现球状或柱状的原基。③疏蕾：随着原基的生长，某些菌株的原基丛生现象较为严重，需用刀具修去生长弱或靠近袋口边缘的小菇蕾。原基生长至乒乓球大小时保留 1～2个使其继续生长。④整个出菇阶段控制温度为8～16 ℃，湿度85%～95%，CO2浓度900～3 000 mg/kg，光照强度大于300 lx。采收称重，观察记录各项农艺性状。

（4）单孢杂交[7]。①杂交亲本的选择：阿魏蘑单孢杂交育种是运用具有不同的遗传特性的单核菌丝体进行杂交，选育出具有优良性状的杂交异核体。因此，杂交亲本需具有不同的优点。从RAPD与 ISSR分子标记的试验结果可以得知供试菌株的遗传相似性等信息。冷房品比试验结果可获得供试菌株的产量及各项农艺性状。根据两项试验结果选择产量高，菇形好，菇质优，抗性强，管理相对方便的菌株作为新品种选育的杂交亲本。②孢子收集：亲本确定后，选取具有亲本典型性状的待收集孢子的3个，至成熟后采收。用酒精将菇体擦拭干净，无菌水冲洗3次，无菌纱布吸干表面水分，用刀具切割成适合于固定在实验室自制的广口玻璃瓶孢子收集器上的小菇块。菌褶面向下，用无菌纱布包好瓶口，静置12～18 h，收集孢子印。为保证收集的孢子纯正，有关操作需在超净工作台上完成。③获取单核体菌丝：采用连续稀释法，即用接种环蘸取2～3次孢子放入10 mL无菌水中，摇匀后吸取1 mL孢子液到9 mL的无菌水中，再次摇匀吸取1 mL孢子液到9 mL无菌水中，以此类推。稀释至 106个/mL后将孢子液涂布于平板培养基。25 ℃恒温避光培养，待孢子萌发菌落直径达5 mm左右移至斜面培养基继续培养。然后用接种针挑取部分菌丝制成水玻片观察是否具有锁状联合。未出现锁状联合的菌丝认定为单核菌丝，并进行编号。④配对杂交：确定杂交亲本组合，将所得单核菌丝经过筛选后一一配对杂交，具体操作是用7 mm打孔器获取的接种块彼此相距1～2 cm接种于平板培养基上，放入 25 ℃恒温箱内避光培养。至两菌落菌丝交合后挑取交合处菌丝放置显微镜 40倍镜下观察有无锁状联合。保留出现锁状联合的杂交组合，未出现则说明两单核菌丝杂交不亲和，予以淘汰。

（5）杂交菌株的筛选。①拮抗试验：拮抗试验是鉴定菌株间遗传差异的传统方法，菌丝之间的拮抗反应是菌株间不同遗传特性的重要表现[8]。利用三点法将具有锁状联合的杂交菌株分别与亲本进行拮抗试验，观察是否出现拮抗线。只有在培养基上两两出现拮抗线，才说明杂交成功，产生了新的性状[9]。排除与亲本未出现明显拮抗线的杂交组合。②母种阶段菌丝生长速度的测定：将符合预期要求的杂交组合与亲本同时接种于平面培养基，每个组合菌株接种5个培养皿，置于25 ℃恒温箱培养，每隔1天观察一次。记录每个杂交菌株菌丝的颜色、密度及生长势。待其中一菌株培养皿内菌丝长满培养基时结束培养，测量其他培养皿内菌落直径。③培养料内菌丝生长速度的测定：新杂交菌株接种到培养料后，待菌丝生长至瓶肩，选取各杂交菌株生长一致的3个菌包进行划线标记，测量菌丝的吃料速度。④瓶栽品比试验：按比例配制培养料，加水拌匀后含水量在62%～64%，每瓶约装入干料270 g，高压灭菌2.5 h，冷却后接种。每种杂交菌株与亲本接种20瓶，设置3个重复，放入培养室内25 ℃避光培养。待菌丝盖面时开始每3天测量菌丝的生长速度并观察其生长势，共测量5次。菌丝长满培养瓶并完成后熟后，移入冷房进行出菇管理，观察记录每个杂交菌株与亲本的产量及菇体色泽、形状、厚度等农艺性状。计算各菌株的生物学效率，筛选出符合研究目的的杂交菌株。⑤杂交菌株分子鉴定：采用 ISSR分子标记技术对筛选出的目的杂交菌株进行鉴别，操作参照1.2（2）。

2 结果与分析

2.1 供试菌株遗传分析

由于使用的是单链引物而且扩增的序列是未知的，因此使用分子标记前要先筛选引物。本试验由115条引物中筛选出22条扩增条带清晰、重复性好的引物。22条引物将供试26个菌株共扩增出37条清晰易辨的多态性 DNA条带。图 1为引物S99、S124对26个供试菌株扩增的ISSR电泳图谱。

图1显示，某一位置有明显条带的记为“1”，没有 条带的记 为 “0”，建立“0、1”矩阵。利用NTSYSpc2.10生物软件构建供试菌株的遗传关系树状图，进行菌株间遗传相似性分析。

图2为筛选后的22条引物将供试菌株扩增和由相关软件分析后得到的聚类分析树状图。由图 2可知，当遗传系数为0.28时，可将供试菌株分为两类，菌株1505-2野阿魏和香阿魏聚为一类，其余供试菌株聚为另一类；当遗传系数为0.53时，供试菌株分为Ⅴ类，第Ⅰ类为白灵 00489、北京白灵、白灵A1、上海高白灵、白灵509、白灵菇、白灵00619、A25、A18、A28、A12、50869、A30、A32、华中白灵、白灵参宝、A1、A8、A6、A14、白灵901；第Ⅱ类为608；第Ⅲ类为白灵A19；第Ⅳ类为A16；第Ⅴ类为1505-2野阿魏、香阿魏。1505-2野阿魏和香阿魏为野生采集的菌株，通过分析属于阿魏蘑菌株，且与其他供试菌株之间的遗传相似系数小，可能存在较大的杂交优势。第Ⅰ类供试菌株根据不同遗传系数又能分为不同的类别，在遗传系数为0.73时又可分为五小类。

图1 引物S99、S124 ISSR指纹图谱

图2 供试阿魏蘑菌株遗传关系树状图

2.2 供试菌株品比试验结果

将完成由营养生长到生殖生长的各供试菌株出菇菌包移入同一间冷房进行出菇品比试验，以保证各种生长条件基本相同，排除环境因素带来的干扰。

（1）出菇同步性。阿魏蘑菌包出菇性状包括现蕾的时间、子实体的性状（大小，形状）和采收时间的一致性。这反映了工厂化生产期间阿魏蘑出菇管理的难易程度。菌包经受冷刺激后，各出菇菌包在较短时间内同时出现原基，子实体大小、形状基本相同，能够同时采收，说明该菌株出菇一致性高，管理较容易。表2为本次试验中26个供试菌株的出菇一致性统计表，催蕾期为从开袋冷刺激催蕾到开始现蕾所需的时间，其时间长短从一定程度上反映了该菌株生长势和生产成本的高低；现蕾期和采收期分别为菌包开始现蕾至全部菌包完成现蕾所需的时间和开始采收至采收结束的时间；育菇时间为菌株平均每菌包从现蕾到采收所需时间，育菇时间长短反映子实体的生长速度。白灵菇出菇一致性的高低由现蕾期和采收期决定，两时期所用时间越短，出菇一致性越高。

表2 供试阿魏蘑菌株出菇各时期所需时间 （单位：d）

由表2可知，供试菌株中催蕾期最短的为白灵A1、白灵901、白灵00489，用时16天；最长的为白灵A16和A14，用时54天；A18与A12催蕾期也较长，分别为50 天和52天。供试菌株的现蕾期最短的是白灵A1，仅需2天；A30、A32、上海高白灵的现蕾期为3天。白灵A1采收期最短，为5天；其次为白灵901和A19，为6天；最长的是香阿魏、A14和A8，需26天。供试菌株中育菇时间最短的菌株是A18，需要8天，其次是A16（9天）、华中白灵（11天）、A19（11天）。

综上所述，出菇一致性较高，出菇管理比较简单的菌株有白灵A1、A30、A32、白灵A19、白灵00489、白灵901。

（2）农艺性状。阿魏蘑作为一种珍稀高档食用菌，在市场上不如平菇、双孢蘑菇一类常见。消费者对白灵菇子实体外观特征及口感的要求较为严格，通常喜欢菇柄较短、菇朵厚实、形状规整洁白的菇体。表3记录了此次试验中各供试菌株的子实体农艺性状。在平均单朵重量方面，以各菌包生长的第一潮子实体测量记录，菌株白灵菇以 363 g位居首位；其次是白灵A19和白灵608，分别为311 g和299 g；平均单朵重量最低的菌株是A32、白灵00619和A30，分别为150 g、148 g和140 g。在子实体形状、色泽方面，野生菌株香阿魏子实体为漏斗状，颜色暗黄且菇柄较长，1505-2野阿魏子实体颜色偏暗，菇柄长，两者均不适合作为亲本。其余供试菌株大部分为掌形、白色。菌株白灵 A1、白灵901菇体洁白；A30、A32、白灵00619、上海高白灵菌株子实体为柱状，其中A30、A32子实体表皮开裂。其他菌株具丛生现象，出菇管理较为复杂。在子实体硬度及厚度方面，菌株华中白灵与A14的硬度大，口感稍差；菌株白灵菇、华中白灵子实体很厚。在菇柄长度与子实体向光性方面，菌株白灵菇菇柄短，向光性较强，整体比较成型；菌株50869、A12子实体向光性极强，对光源的位置敏感。

表3 供试阿魏蘑菌株的农艺性状

此次研究需要选择遗传差异大，出菇一致性高且具有突出农艺性状的菌株作为杂交亲本。通过2.1与2.2节对供试菌株遗传分析、出菇一致性及各项农艺性状的比较分析可知，菌株白灵菇、白灵A19与白灵A1相互之间遗传差异大，菌株白灵菇虽然出菇一致性不明显，但是其产量为供试菌株中最高；白灵A1子实体洁白、掌形，出菇一致性高，管理方便；白灵A19椭圆形，子实体形状统一，出菇一致性高；白灵A1与白灵A19菌株的产量也较高。经过综合比较后，本次试验选择菌株白灵菇、白灵A19和A1作为杂交亲本，图3 b、c、d为杂交亲本子实体生长状况。对3个亲本进行拮抗试验，结果如图3 a所示，菌株白灵菇与白灵A19、白灵A1均有拮抗线产生，而白灵A19与白灵A1之间无拮抗线产生，又根据亲本各自相对突出的性状，最终以白灵菇（A）×白灵A19（B）、白灵菇（A）×白灵A1（C）这两种作为此次试验的杂交组合。

2.3 单孢杂交

（1）单核体收集。确定杂交亲本后，收集孢子印，稀释涂板，25 ℃恒温培养，挑取萌发的单菌落于平面培养基上继续培养。培养一段时间后观察菌丝形态，具有星射线的菌落一般为单核体菌株。显微镜下 40倍镜检是否具有锁状联合结构。试验挑取的白灵菇、白灵A19、白灵A1的单菌落数和单核体数分别为46、39、42和28、24、30。

（2）配对杂交。在白灵菇（A）×白灵 A19（B）杂交组合中，分别选取白灵菇、白灵A19单核体菌落各10个，计100种配对组合进行杂交；在白灵菇（A）×白灵A1（C）杂交组合中，选取白灵菇单核菌株11个，白灵A1单核菌株（图4）16个进行配对杂交，计176种组合。经镜检，A×B杂交得到 59个具有锁状联合结构标记的组合；A×C杂交得到127个具有锁状联合标记的组合。

图4 部分杂交组合菌丝显微图

图3 杂交亲本拮抗试验及子实体生长状况

图5 拮抗试验

2.4 杂交菌株的筛选

利用三点法将具有锁状联合结构的杂交组合与亲本进行拮抗试验，部分拮抗结果如图5所示。其中A×B杂交中，与亲本A产生拮抗线而不与亲本B产生拮抗线的有3个杂交组合，与亲本A不产生拮抗线而与亲本 B产生拮抗线的有 9个杂交组合，剩余 47个杂交组合与两亲本均能产生明显的拮抗线；A×C杂交中，与亲本A产生拮抗线而不与亲本C产生拮抗线的有1个杂交组合，与亲本A不产生拮抗线而与亲本C产生拮抗线的有2个杂交组合，剩余127个杂交组合与两亲本均能产生明显的拮抗线。杂交组合A×C的杂交亲和率高于A×B组合。

3 小结与讨论

育种工作的关键在于亲本的选择，而实验方法也至关重要。分子标记技术具有简单快速、准确低耗等特点，本研究首先利用RAPD与ISSR分子标记技术对 26个供试菌株进行分子水平上的分析鉴定；结合冷房出菇品比试验获得了各供试菌株的农艺性状。根据试验的设计思路及实验结果，选择具有突出农艺性状和性状之间互补及遗传差异较大的菌株白灵A19、白灵A1及菌株白灵菇作为此次育种研究的亲本。通过对遗传树图的分析与亲本间的拮抗试验，确定了白灵A19×白灵菇、白灵A1×白灵菇两个杂交组合，且后者的杂交亲和率高于前者。根据试验流程，共获得174个有效杂交组合。对这174个杂交组合还需进行重复品比试验，并应用经本次试验筛选后的分子标记引物，对表现良好的杂交菌株进行 ISSR分子标记鉴定，测定其是否属于阿魏蘑新品种。